2022 年 9 月，來自云南省第一人民醫(yī)院骨外科的研究團隊在?J Cachexia Sarcopenia Muscle?雜志上合作發(fā)表了題名為“Single-cell RNA-seq reveals interferon-induced guanylate-binding proteins are linked with sarcopenia”的研究論文，本研究利用單細胞 scRNA-seq 在構(gòu)建的肌肉減少癥小鼠模型中進行檢測，提供了骨骼肌的詳細單細胞圖譜。研究表明，內(nèi)皮細胞在肌少癥中發(fā)揮重要作用，且存在不同的內(nèi)皮細胞亞型，肌少癥的內(nèi)皮細胞在表達層面、富集層面都與正常的內(nèi)皮細胞存在差異，通過表達、富集和細胞互作等分析，表明內(nèi)皮細胞可能通過干擾素誘導(dǎo)的 Gbp 信號通路在肌肉減少癥，而在臨床樣本中也發(fā)現(xiàn)了部分患者內(nèi)皮細胞 GBP 基因的異常。因此，干擾素-GBP 相互作用可能是治療年齡相關(guān)性肌肉減少癥的一個有希望的新靶點。該研究中單細胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】J Cachexia Sarcopenia Muscle【發(fā)布時間】2022年9月【影響因子】12.063【檢測技術(shù)】10x Genomics 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

科學(xué)問題

肌肉減少癥是一種描述為骨骼肌質(zhì)量和/或肌肉力量進行性下降的病癥。由于年齡是這種綜合征的主要風(fēng)險因素之一，因此肌少癥越來越被認為是老齡化人口面臨的一項重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，這對醫(yī)療保健系統(tǒng)構(gòu)成了相當(dāng)大的經(jīng)濟負擔(dān)。因此，迫切需要了解這種疾病并開發(fā)新的預(yù)防和治療方法。
許多研究努力了解驅(qū)動肌少癥的機制，目前已觀察到年齡相關(guān)的變化與肌少癥的發(fā)病機制有關(guān)，然而，這些研究中的大多數(shù)使用微陣列芯片或 bulk RNA-seq，這只能反映各種細胞類型混合物的平均基因表達。雖然有文章報道，使用單核測序來研究肌肉細胞組成中與年齡相關(guān)的變化，然而肌少癥仍缺乏單細胞水平的直接研究。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1.?小鼠肌少癥模型的構(gòu)建

根據(jù)文獻報道，建立了小鼠 P6DX 肌少癥模型（圖1 A），對體重、肌肉細胞計數(shù)、橫截面纖維面積、骨骼肌的肌肉結(jié)構(gòu)等表型進行評估，結(jié)果都表明成功建立了肌少癥模型。（圖1 B-F）。

2.?小鼠骨骼肌中不同的細胞組成

對三組（對照組、假手術(shù)組、肌少癥組）的小鼠骨骼肌樣本進行了 scRNA-seq。首先建立了肌少癥的骨骼肌單細胞圖譜，根據(jù)細胞標(biāo)志物進行細胞類型鑒定（圖2 A-C）。根據(jù)細胞占比分析，則發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮 1 和內(nèi)皮 2 是最豐富的細胞類型，且來源顯示出組間異質(zhì)性（圖2 B-D），這表明來自肌少癥的內(nèi)皮細胞具有與穩(wěn)態(tài)狀態(tài)內(nèi)皮所不同的轉(zhuǎn)錄組譜。

3.?特異性內(nèi)皮細胞的異質(zhì)性

內(nèi)皮細胞來源顯示出組間異質(zhì)性，表明內(nèi)皮細胞可能在肌少癥中起重要作用。隨后觀察肌少癥組的內(nèi)皮細胞 EC1 與對照組的內(nèi)皮細胞?EC2 不同，這表明內(nèi)皮細胞可能在肌肉減少癥中起重要作用。隨后比較了肌少癥組的內(nèi)皮細胞 EC1 和對照組內(nèi)皮細胞 EC2 的差異（圖3 A-B），根據(jù)差異分析，發(fā)現(xiàn)干擾素相關(guān)基因和 Gbps 相關(guān)的基因在內(nèi)皮的組間存在較大差異，因此說明干擾素誘導(dǎo)的 Gbps 可能在肌少癥的發(fā)病過程中具有新的作用。

隨后進行 GSEA 分析以研究兩種內(nèi)皮各自的富集通路。在 Reactome 通路中，干擾素信號相關(guān)通路在內(nèi)皮 2 中屬于最高的陽性富集通路，細胞因子相關(guān)通路也呈正態(tài)的富集（圖3 C）。在 GO 功能中，細胞因子介導(dǎo)的通路、細胞對細胞因子刺激的反應(yīng)和對干擾素?γ?的反應(yīng)是高度富集的功能（圖3 C）。而基因表達結(jié)果也顯示，干擾素信號通路相關(guān)的基因在內(nèi)皮 2 中顯著高表達（圖3 D）。

4.?肌少癥中的細胞相互作用

為了研究肌少癥中細胞通訊是否受到干擾，使用 CellChat 推斷細胞的相互作用，并比較三個組之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。使用 Endothelial_major 代替不同組中主要的內(nèi)皮細胞（對照組的 EC1，實驗組的 EC2）?？傮w而言，對照組中推斷出更多的細胞相互作用，而在大多數(shù)細胞類型中，實驗組的相互作用較少且作用強度較低（圖4 A-E）。這些結(jié)果共同表明肌少癥中細胞的通訊受到損害，并可能歸因于肌少癥的發(fā)生。

5.?小鼠和人類肌少癥活檢中 Gbp2 的異常表達

從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中，觀察到實驗組內(nèi)皮細胞中 Gbp2 的異常高表達，隨后使用不同的實驗驗證。首先通過蛋白質(zhì)印跡評估了 Gbp2 的表達（圖5 A-B），與其它兩組相比，實驗組中 Gbp2 的蛋白質(zhì)顯著的高表達。隨后也使用免疫熒光進一步檢查了 Gbp2 的表達，在實驗組的內(nèi)皮細胞中廣泛的檢測到 Gpb2 的表達，但在對照組中大多不存在Gbp2 的表達，且實驗組中 Cd31 和 Gbp2 存在共定位的比例顯著高于其它兩組（圖5 C）。

隨后也在人類肌少癥患者中通過免疫熒光進行驗證，總體而言，發(fā)現(xiàn) 27.5%（40?名中的 11 名）患者在表現(xiàn)出顯著的 GBP2 表達，且發(fā)現(xiàn) CD31 和 GBP2 的共定位比例也顯著高于對照組。

6.?GBP2 的過表達導(dǎo)致內(nèi)皮細胞血管形成受損

血管形成測定是體外血管生成評估的一種方法。在本研究中，構(gòu)建了 HUVEC-GBP2 過表達細胞，通過蛋白質(zhì)印跡驗證 GBP2 的過表達（圖6 A-B）。在血管形成測定中，發(fā)現(xiàn) GBP2 過表達組的血管形成能力顯著降低，沒有觀察到明顯的細胞聚集形成血管，而在對照組中發(fā)現(xiàn)了明顯的血管形成（圖6 C）。

研究結(jié)論

本研究利用單細胞?scRNA-seq 在肌肉減少癥小鼠模型中進行檢測，提供了骨骼肌詳細的單細胞圖譜。結(jié)果表明，內(nèi)皮細胞存在不同的亞型，且在肌少癥中發(fā)揮重要作用，肌少癥的內(nèi)皮細胞在轉(zhuǎn)錄方面、功能富集方面都與正常的內(nèi)皮細胞存在差異，通過細胞互作分析，表明肌少癥的內(nèi)皮細胞可能通過干擾素誘導(dǎo)的 Gbp 信號通路發(fā)揮作用，而在臨床樣本中也發(fā)現(xiàn)了部分患者內(nèi)皮細胞 GBP 基因的異常。因此，干擾素-GBP 相互作用可能是治療肌少癥的一個潛在治療靶點。

參考文獻：
Peng Z, Zhang R, Kuang X, et al. Single‐cell RNA‐seq reveals interferon‐induced guanylate‐binding proteins are linked with sarcopenia[J].?Journal of Cachexia,?Sarcopenia and Muscle, 2022.

博奧晶典科研服務(wù)事業(yè)部 張議丨文案

文中部分配圖源于網(wǎng)絡(luò)???侵刪