原核表達是表達外源基因常用的方法，具有操作簡單、快捷，需時較短，表達產(chǎn)量高，適合工業(yè)化等優(yōu)點。將植物、動物、微生物等的目的基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。原核蛋白表達用于表達重組蛋白有以下優(yōu)點：易于生長和控制；易于培養(yǎng)，實驗耗費少；可選擇多種大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)粒。原核表達是近年來表達外源蛋白常用的方法，本文根據(jù)自己的實踐經(jīng)驗，著重談談對原核表達中的技巧問題。

1.表達前的準備要素：原核表達注重表達前對目的片段、表達載體及表達菌株的分析、選擇。正所謂“磨刀不誤砍柴功”，經(jīng)過細致、周全的分析、準備、設計可帶來較為順當?shù)膶嶒?，可免去許多不必要的麻煩。

（1）對表達載體的分析

載體的選擇：同樣的載體，同樣的系統(tǒng)，很可能表達這個蛋白表達量起高，但另外一個就是做不出來，所以表達載體的選擇非常重要，沒有萬能的載體。選擇載體通常我們關心質(zhì)粒上的幾個功能組件及所帶來的問題：是否為誘導表達型載體，啟動子的強弱、多克隆位點、限制性內(nèi)切酶的位置、終止密碼子的有無及位置，融合Tag的有無，篩選報告基因的位置等。所選載體一定要保持原來的遺傳背景（有些載體經(jīng)過多次交換已變異）。選擇表達載體時，要根據(jù)所表達蛋白的最終應用考慮，如果為了方便純化，可選擇融合表達；如果為了獲得天然蛋白，可選擇非融合表達。融合表達時在選擇外源DNA同載體分子連接反應時，對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結構的閱讀不能發(fā)生干擾。

翻譯的起始位點：要表達目的蛋白，在該基因的5’端必須有一起始位點，現(xiàn)在大部分的表達載體都提供起始位點，起始密碼子與核糖體結合位點的距離都已被優(yōu)化，一般情況下不需要自己再加，實際操作時要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子，如無，還得根據(jù)自己的實際情況加上。

在起始密碼子附近的mRNA二級結構：外源基因其始轉(zhuǎn)錄后，保持mRNA的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達的關鍵，尤其是在起始密碼子附近的mRNA二級結構可能會抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產(chǎn)生不完全的蛋白。如果利用Primer Premier軟件分析DNA或RNA結構上有柄（stem）結構，并且結合長度超過8個堿基，這種結構會因為位點專一突變等因素而變得不穩(wěn)定，影響正常的翻譯。 一般做原核蛋白表達服務的公司都會進行優(yōu)化。

（2）對目的片段的分析

基因（或蛋白）的大?。涸吮磉_的成功與否與所要表達的蛋白（或基因）大小有關，一般說來小于5kD或者大于100kD的蛋白表達都是較難的的。蛋白越小，越容易被內(nèi)源蛋白水解酶所降解。在這種情況下可以采取串聯(lián)表達，在每個表達單位（即單體蛋白）間設計蛋白水解或者是化學斷裂位點。如果蛋白較小，那么加入融合標簽GST、Trx、MBP或者其它較大的促進融合的蛋白標簽就較有可能使蛋白正確折疊，并以融合形式表達。如果蛋白較大，大于60kD的蛋白建議使用較小的標簽（如6×組氨酸標簽）。對于結構研究較清楚的蛋白可以采取截取表達。當然表達時要根據(jù)目的進行截取，如果是要進行抗體制備而截取，那么一定要保證截取的部位抗原性較強。對于抗原性也可以利用軟件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在線軟件，不過在分析之余也要認識到這是一種資料統(tǒng)計的結論，如果蛋白和免疫動物親緣關系較遠的話還是不妨一試的。

表達序列的GC含量：表達序列中的GC含量超過70％的時候可能會降低蛋白在大腸桿菌中的表達水平。GC含量可以利用DNA STAR、VectorNTI Suite等軟件進行預測。

親疏水性：經(jīng)常做表達的人都發(fā)現(xiàn)表達親水區(qū)域時表達量會比較高，如果你要表達一個膜蛋白，它的疏性會增加實驗難度。有許多軟件可以對氨基酸的親疏水性進行分析，比如VectorNIT Suite，除此之外還可以利用在線跨膜區(qū)預測軟件對跨膜區(qū)進行預測。

2.原核表達系統(tǒng)——獲得目的基因

基因工程中，目的基因的制備有直接分離法、構建基因組文庫分離法，構建cDNA基因文庫分離法、聚合酶鏈式反應擴增法（PCR）和化學合成法。原核表達一般都是利用PCR把目的基因克隆擴增出來。PCR法的關鍵是設計引物，可以使用兩個軟件，PrimerPremier或者Oligo來分析。如果要表達全長，用不著考慮太多，從一頭一尾找至少8個匹配序列在加上與載體匹配的序列就行。注意以下幾點：、先查查表達外源片段中含有什么內(nèi)切酶位點，否則設計重了，酶切后電泳就會老發(fā)現(xiàn)有預期外的小片段出現(xiàn)。根據(jù)載體上的酶切位點設計引物，現(xiàn)在許多類似T載原理的克隆方法也可以應用到原核表達中，如果T載克隆方法要定向，設計引物時很多時候要多加4個堿基。、在設計酶切位點的5端要加保護堿基，使限制性內(nèi)切酶能有效識別，不同內(nèi)切酶所需的保護堿基不同，SalⅠ不需要保護堿基，EcoRⅤ需要1個，NotⅠ需要2個，HindⅢ最好有3個，一般情況下，都設計2個，可參考有關書籍。、特別 注意起始密碼子和終止密碼子的讀碼框，不要造成目的片段堿基移碼。如果載體上有起始密碼子ATG，可不另加，但是通常ATG后不是緊跟外源片段的，中間還含有載體序列，這種情況一定要保證中間這段序列不會造成你外源序列的移碼。按情況需要，可以加1到2個堿基在引物中使讀碼框正確。同理，正常的終止密碼子才能保證蛋白的產(chǎn)出。大部分載體也有終止密碼子，如果你對載體的不放心，也可以在引物中設計上終止密碼子。、在PCR反應體系中，引物的最適濃度為0.1-1.0umol/I。引物過多會影響PCR的產(chǎn)量。⑥所設計的一對引物之間的Tm值相差不宜過大，最好能一樣。一般來說，PCR反應的退火溫度不超過Tm值上下5℃；⑦一對引物不宜形成發(fā)夾結構、互相配對，若配對時最好不要是G-C的結合（可以用軟件分析）；⑧3端以G、C結尾為宜；⑨把上游引物設計成有義鏈，下游設計成反義鏈，否則沒有片段出現(xiàn)。

3.構建重組表達載體

將目的片段有效地插入表達載體中是原核表達中較為關鍵的步驟，一般構建的重組載體有插入重組和置換重組兩種類型，優(yōu)先考慮能產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶，以便高效連接。作者將構建重組表達載體分為酶切過程和連接過程。

（1）酶切過程：將目的片段和表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，用試劑盒回收有效片段。酶切反應體系首先應根據(jù)所切底物的大小和濃度計算出限制性內(nèi)切酶的用量，試劑公司提供的限制性內(nèi)切酶包裝上通常標明總的酶活性單位和容積活性。對于能被高效切割的DNA樣品（起決于特定的識別序列）用酶量少，反之則多。

（2）連接過程：在T4DNA連接酶作用下，載體和片段連接。連接反映體系中，連接酶的用量越大，反應速度越大，但用量過大，酶液中的甘油會影響連接效果，也會造成浪費，一般20μl體系中用5U足夠。另外，連接酶的最適溫度雖為37℃，在此溫度中酶的活性最高，但此溫度能使粘性末端的氫鍵結合不穩(wěn)定，易脫開。建議在26℃，4h反應可得較好效果。目的片段和載體的摩爾比例在2：1（或3：1）為好，DNA總量應根據(jù)實際濃度控制在一定范圍，多了，DNA分子運動慢，反而影響連接效果，假陽性多。少了，片段和載體在反映體系中難以碰撞連接，以至沒有連接的菌落。20μl體系中，10μl底物即可。

4.轉(zhuǎn)化如原核表達宿主菌

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，根據(jù)重組載體的標志（如抗Amp或藍白斑）作篩選，挑取單菌落，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，用PCR和雙酶切法作初步鑒定后進行測序驗證，進一步檢測目的基因的插入方向、閱讀框架及片段序列是否正確。測序時可挑選多個菌落進行測定，因為在PCR、連接等過程中，有不確定因素會導致目的片段發(fā)生堿基錯配甚至移碼突變。將經(jīng)過測序分析正確的大腸桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。

5.誘導表達

原核表達服務實驗，一般需要誘導表達，誘導表達過程中，把構建好的載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中表達，不同的表達載體對應有不同的表達菌株，一些特別設計的菌株更有助于解決一些表達難題。在此不再多說，請參照有關書籍。

6.表達蛋白的分析、純化、檢測

誘導表達成功后，表達蛋白的分析、純化、檢測應該順當，按一般的實驗步驟做沒太大的問題。

雖然，在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少高級修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構象等缺點，但原核表達具有的操作簡單、快捷，需時較短，表達產(chǎn)量高，適合工業(yè)化等優(yōu)點，仍是我們合成外源蛋白的首選。原核表達的全過程有許多不確定因素，所以每完成一步都得檢驗結果是否正確，當實驗遇到困難時如何進行分析，找到問題的癥結是我們實驗的關鍵。

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