根據(jù)之前自己的研究基礎(chǔ)或文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)了一個感興趣的基因，卻不知道如何圍繞這個基因開展后續(xù)的實驗？不要發(fā)愁，小薇今天就為你帶來一篇高分文獻(xiàn)，了解一下此類情況實驗應(yīng)該如何設(shè)計和開展。

首先來一點背景介紹吧：腺相關(guān)病毒(AAV)是細(xì)小病毒家族的一員，可在臨床試驗和實驗動物模型中用于感染人類。在人類臨床試驗中使用AAV載體進(jìn)行基因治療已顯示出前景，因為AAV通常會引起非常溫和的免疫反應(yīng)和長期的基因轉(zhuǎn)移。另外關(guān)于作者研究的目標(biāo)基因也是他之前通過大量文獻(xiàn)閱讀發(fā)現(xiàn)的一個感興趣的基因GlyRα1/3。

今天小薇要介紹的這篇文章利用AAV8在F11神經(jīng)元細(xì)胞中轉(zhuǎn)移GlyRα1/3基因，研究質(zhì)粒腺相關(guān)病毒(pAAV)-GlyRα1/3對細(xì)胞毒性和PGE2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響和作用。并對SD大鼠鞘內(nèi)給藥AAV-GlyRα3的緩解CFA誘導(dǎo)的炎癥性疼痛的潛力進(jìn)行了評估。這篇文章今天發(fā)表于Molecular Medicine，影響因子6.354分。

下面我們就來了解一下這篇文章是如何設(shè)計和實施的吧：

主要材料與方法

1. 準(zhǔn)備F11細(xì)胞以及SD大鼠；

2. 實驗?zāi)康募胺纸M：研究pAAV-GlyRα1/3對F11神經(jīng)元細(xì)胞系細(xì)胞毒性和PGE2調(diào)控的炎癥反應(yīng)的影響；大鼠分為4組: 鞘內(nèi)注射AAV-GlyRα3加CFA組 (Gα3F組，n = 9); 鞘內(nèi)注射AAV加CFA組 (GVF組，n = 6); 鞘內(nèi)注射NaCl加CFA組 (GNF組，n = 9)；和正常對照組 (N組，n = 6)；

3. 構(gòu)建pAAV- GlyRα1和pAAV-GlyRα3重組載體；

4. 將pAAV- GlyRα1和pAAV-GlyRα3分別轉(zhuǎn)染至F11細(xì)胞中；

5. 檢測細(xì)胞活力；

6. 檢測病毒滴度；

7. 大鼠鞘內(nèi)注射NaCl，AAV或AAV-GlyRα3，足底注射CFA；

8. 大鼠行為檢測；

9. WB、免疫組化、ELISA等實驗；

主要結(jié)果

1、pAAV/pAAV-GlyRα1/3轉(zhuǎn)染不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。

用pAAV，pAAV-GlyRα1或pAAV-GlyRα3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及僅用Lipofectamine處理的細(xì)胞顯著減少。pAAV，pAAVGlyRα1或pAAV-GlyRα3組的細(xì)胞活力低于Lipofectamine處理組。該發(fā)現(xiàn)表明，pAAV-，pAAV-GlyRα1-或pAAV-GlyRα3轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力下降是由Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑引起的。但是，不能完全排除由pAAV，pAAV-GlyRα1或pAAV-GlyRα3轉(zhuǎn)染引起的細(xì)胞毒性。

2、pAAV/pAAV-GlyRα1/3轉(zhuǎn)染不誘導(dǎo)ERK磷酸化或ATF-3活化

1)PGE2給藥和細(xì)胞收集用于測量ERK磷酸化和ATF-3的時間表顯示在圖1A中，在給藥PGE2后30-60分鐘ERK的磷酸化顯著增加,而ATF-3未被激活 (圖1B，D)。2)?用于測量ERK磷酸化和ATF-3活化的病毒轉(zhuǎn)染和細(xì)胞收集的時間表顯示在圖1E中。Lipofectamine顯著誘導(dǎo)ERK磷酸化 (圖1F，G) 和ATF-3活化 (圖1F，H)。3)?檢查載體對F11細(xì)胞中PGE2-誘導(dǎo)的 ERK磷酸化的影響的時間表如圖1I所示。發(fā)現(xiàn)PGE2給藥誘導(dǎo)ERK磷酸化; 然而，預(yù)轉(zhuǎn)染的pAAV-GlyRα3顯著抑制了PGE2誘導(dǎo)的ERK磷酸化 (圖1J，K)。（有沒有發(fā)現(xiàn)圖D沒有誤差線？想不到高分文獻(xiàn)也有這種bug，不知道是忘了加還是壓根兒就沒做重復(fù)......）

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3、阻斷甘氨酸受體抑制PGE2誘導(dǎo)的ERK磷酸化

圖2A顯示了應(yīng)用EP2-和甘氨酸受體拮抗劑pf-04418948和strychnine的時間表。結(jié)果表明，pf-04418948和strychnine下調(diào)PGE2-誘導(dǎo)的 ERK磷酸化，表明EP2和GlyRs對于PGE2-誘導(dǎo)的 ERK磷酸化是必不可少的 (圖2B，C)。此外，在PGE2處理前30分鐘施用的廣譜PKC抑制劑G06983也導(dǎo)致PGE2-誘導(dǎo)的 ERK磷酸化的顯著降低 (圖2B，C)。

4、DRG中的神經(jīng)元細(xì)胞毒性和ATF-3表達(dá)

圖3A顯示在鞘內(nèi)注射AAV-GlyRα3進(jìn)入SD大鼠后6周觀察到GFP的表達(dá)，并在8周時在L5 DRGs中放大。雙重免疫熒光染色顯示GlyRα3和NeuN共定位在L5 DRG的神經(jīng)元中 (圖3A)。因此選擇在鞘內(nèi)注射NaCl，AAV或AAV-GlyRα3后8周給予CFA足底內(nèi)注射。此外，與正常對照組相比，鞘內(nèi)NaCl + CFA注射液(GNF組)、AAV + CFA注射液(GVF組)、AAV- GlyRα3 + CFA注射液(Gα3F組)明顯上調(diào)了L5 DRGs中ATF-3的表達(dá)(圖3B、C)。Gα3F組與GNF組比較發(fā)現(xiàn)，Gα3F組ATF-3的表達(dá)略有降低。鞘內(nèi)給藥AAV、AAV- glyr α3后，DRG神經(jīng)元保持完整性；鞘內(nèi)注射可引起輕微神經(jīng)元損傷(圖3B, C)。

5、鞘內(nèi)注射AVV-GlyRα3可顯著降低CFA誘導(dǎo)的炎性疼痛

在鞘內(nèi)注射NaCl，AAV和AAV-GlyRα3組中，直到CFA后爪注射前兩個月，對傷害性熱刺激 (熱痛覺過敏，圖4A) 和機械刺激 (機械痛覺異常，圖4B) 的后爪戒斷反應(yīng)與基線無顯著差異。此觀察結(jié)果表明，炎性疼痛不是由鞘內(nèi)注射引起的。然而，此后不久，皮下足底CFA注射引起炎性疼痛，鞘內(nèi)注射AAV-GlyRα3組持續(xù)兩天，鞘內(nèi)注射AAV，NaCl組在第四天恢復(fù)正常反應(yīng)。但鞘內(nèi)AAV-GlyRα3給藥組 (Gα3F組) 疼痛明顯減輕。與GNF組相比，無論熱刺激還是機械刺激，疼痛都能持續(xù)三天 (圖4，符號 *)。盡管在本研究中鞘內(nèi)注射AAV后發(fā)現(xiàn)了輕度的疼痛緩解作用。然而，當(dāng)將鞘內(nèi)AAV-GlyRα3組與鞘內(nèi)AAV組進(jìn)行比較時，觀察到緩解疼痛效果的顯著差異 (圖4，由符號 # 表示)。這些結(jié)果表明，在CFA誘導(dǎo)的大鼠模型中，鞘內(nèi)注射AAV-GlyRα3可產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛作用。

6、AAV-GlyRα3抑制CFA誘導(dǎo)的大鼠DRG中的細(xì)胞因子激活

與正常對照組相比，GNF，GVF和Gα3F組顯著誘導(dǎo)L5 DRG中的ERK激活 (圖5A，B)。然而體內(nèi)結(jié)果表明，當(dāng)將GNF組與Gα3F組相比時，AAV-GlyRα3可以顯著抑制DRG中的ERK磷酸化 (圖5A，B)。用NeuN (圖5C) 或GFAP (圖5D) 對p-ERK進(jìn)行雙重免疫熒光標(biāo)記顯示，p-ERK可以位于DRG中的神經(jīng)元 (圖5C) 和衛(wèi)星神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 (圖5D) 中。然而，CFA誘導(dǎo)的p38磷酸化不被AAV-GlyRα3的鞘內(nèi)給藥所抑制 (圖5E)。用p-p38和NeuN或p-p38和NF200雙重免疫熒光標(biāo)記顯示p-p38在小神經(jīng)元上表達(dá) (圖5F，G)。

7、AAV-GlyRα3抑制CFA誘導(dǎo)的大鼠DRG中的細(xì)胞因子激活

在體外研究了pAAV，pAAVGlyRα1和pAAV-GlyRα3對CFA誘導(dǎo)的F11細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的影響。ELISA實驗的時間表顯示在圖S5A中。TNF-α (圖S5B) 、IL-1β (圖S5C) 和IL-6 (圖S5D) 在碳還原的F11細(xì)胞或用pAAV、pAAVGlyRα1或pAAV-GlyRα3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未誘導(dǎo)。在體內(nèi)實驗中，研究了AAV-GlyRα3在CFA誘導(dǎo)的神經(jīng)元炎癥中的潛在參與。結(jié)果顯示AAV-GlyRα3基本上抑制了DRG中CFA誘導(dǎo)的TNF-α (圖6A) 、IL-1β (圖6B) 和IL-6 (圖6C) 活化。

文章看似復(fù)雜，其實仔細(xì)拆解一下你就會發(fā)現(xiàn)作者主要做了兩方面的研究：體外轉(zhuǎn)染探究目標(biāo)基因?qū)?xì)胞毒性、藥物處理前后特定基因的磷酸化影響；體內(nèi)實驗轉(zhuǎn)染探究目標(biāo)基因?qū)FA誘導(dǎo)的大鼠的炎癥情況以及細(xì)胞因子的影響。

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