二，His-Tag重組蛋白親和層析實(shí)驗(yàn)所需材料

His-Tag重組蛋白親和層析實(shí)驗(yàn)材料
瓊脂糖凝膠中鎳親和柱、紫外探測(cè)器、蛋白質(zhì)電泳裝置及配件，如夾子、玻璃板、灌封支架、緩沖罐等。、5毫升注射器
0.45μm過(guò)濾器、超聲波干擾器
His-Tag重組蛋白親和層析試劑：
1.結(jié)合緩沖液：20 mM Tris HCl，150 mM NaCl，10 mM咪唑，pH=8.0
2.洗脫緩沖液：20 mM Tris HCl，150 mM NaCl，不同濃度的咪唑，pH=8.0
3.20%乙醇
4.三蒸餾水
5.透析液：20 mM Tris HCl，1 mM EDTA，pH=8.0
注：純化過(guò)程中使用的所有試劑都用三種蒸餾水定容。溶液制備后，用0.22μm濾膜過(guò)濾，并在4℃下保存。
在本實(shí)驗(yàn)中，可以先配制出相應(yīng)pH值的高濃度母液，使用時(shí)稀釋。例如：
（1） 1 M Tris HCl，pH=8.0
稱(chēng)取60.57 g Tris，溶于400 mL三蒸餾水中，充分溶解，調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入三份蒸餾水，使其體積達(dá)到500 mL。用0.22μm濾膜過(guò)濾，并在4℃下保存在玻璃瓶中。
（2） 2.5 M NaCl，pH=8.0
稱(chēng)取36.53g氯化鈉，溶于200ml三蒸餾水中，充分溶解，調(diào)節(jié)pH至8.0，加入三蒸餾水至250ml，用0.22μm濾膜過(guò)濾，4℃保存于玻璃瓶中。
（3） 1 M咪唑，pH=8.0
稱(chēng)取咪唑17.02g，溶于200ml三份蒸餾水中，充分溶解，調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入三份蒸餾水至250ml，用0.22μm濾膜過(guò)濾，4℃保存于玻璃瓶中。
三，His-Tag重組蛋白親和層析實(shí)驗(yàn)步驟
3.1 準(zhǔn)備樣品
將IPTG誘導(dǎo)的菌液以7000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集菌細(xì)胞，用PBS沖洗兩次，再用純化用的平衡液漂洗一次，最后在平衡液（35mL/g菌球）中重新懸浮，超聲破碎收集的菌液至澄清，13000離心機(jī)轉(zhuǎn)速10分鐘，取上清液，用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾。
3.2 工藝過(guò)程
3.2.1準(zhǔn)備
打開(kāi)蓋子后，在4℃下儲(chǔ)存的試劑經(jīng)超聲脫氣40分鐘，并平衡至純化溫度。
3.2.2打包列
裝填塔前，將三蒸餾水注入塔中，打開(kāi)開(kāi)關(guān)至最大流量，使三蒸餾水快速流過(guò)色譜柱，消除塔中的氣泡。4℃時(shí)從冰箱中取出凝膠填充物，用吸管吸干上層20%乙醇，加入三份蒸餾水輕輕再懸浮，緩慢加入柱內(nèi)，再注入三份蒸餾水，打開(kāi)開(kāi)關(guān)至最大流速，保持柱垂直，必要時(shí)使凝膠致密，你可以用注射器從出口輕輕吸出，給凝膠施加一定的負(fù)壓，使凝膠更致密。3.2.3.平衡
提前打開(kāi)紫外檢測(cè)器，將波長(zhǎng)調(diào)至280nm，靈敏度100%，預(yù)熱。向色譜柱內(nèi)注入結(jié)合緩沖液，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，使液體以恒定速率（3ml/min）向下流動(dòng)。此時(shí)，調(diào)整光量，使吸光度值穩(wěn)定在100。此時(shí)，它被調(diào)整為滿。吸光度穩(wěn)定后，將靈敏度調(diào)整到0.5A/0.2A，使吸光度穩(wěn)定在0。此時(shí)，是基線調(diào)整。
3.2.4.加載
在預(yù)處理樣品中加入20mM咪唑，有時(shí)根據(jù)不同蛋白質(zhì)特性增加樣品中咪唑的濃度，以減少非特異性結(jié)合。沿墻慢慢加入柱內(nèi)，以防產(chǎn)生氣泡。打開(kāi)開(kāi)關(guān)，使流速盡可能低（1ml/min）。當(dāng)吸光度值大于20時(shí)，用50毫升離心管連接流出的蛋白質(zhì)溶液并稱(chēng)其流過(guò)。流經(jīng)的蛋白質(zhì)應(yīng)該是不與凝膠結(jié)合的細(xì)菌蛋白質(zhì)。
3.2.5.洗滌
沿壁面緩慢加入結(jié)合緩沖液，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，以3ml/min的流速取大于10個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液，使吸光度恢復(fù)到基線或接近基線水平。
3.2.6.洗脫
對(duì)于一種新的重組蛋白的初始純化，一般選擇40mm、60mm、80mm咪唑作為流動(dòng)洗滌濃度，主要洗脫凝膠中的非特異結(jié)合細(xì)菌蛋白，以100mm、200mm、300mm咪唑?yàn)橄疵搫?。濃度主要洗脫靶蛋白?00mm咪唑洗脫頑固結(jié)合在凝膠上的蛋白質(zhì)。對(duì)每個(gè)洗脫濃度的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS電泳檢測(cè)，確定洗脫雜質(zhì)蛋白和目標(biāo)蛋白的最佳濃度作為后續(xù)洗脫條件。在每個(gè)洗滌濃度（關(guān)）下，吸光度值必須達(dá)到穩(wěn)定的最小值。一般使用與流動(dòng)洗滌一樣多的洗滌液。
3.2.7.平衡
在最終洗脫后，添加結(jié)合緩沖液，直到吸光度平衡基線或接近基線水平。
3.2.8.保存
緩慢地向柱中加入5倍凝膠體積的20%乙醇，使凝膠完全浸入乙醇中。最后，緩慢地在乙醇中重新懸浮凝膠，取出并放置在干凈的離心管中，用乙醇沖洗柱幾次，以盡量減少凝膠的損失。記錄使用情況，并將凝膠保存在4°C。
3.2.9.透析
（1） 將保存在4°C的透析袋從水中（用于煮沸透析袋的去離子水）中取出，戴上一次性手套，取出水，折疊一端，用密封夾密封。透析液滲漏試驗(yàn)。
（2） 倒出透析液，將不同梯度洗脫的蛋白質(zhì)加入透析袋中，折疊上口，用密封夾密封。檢查有無(wú)滲漏后，放入2L透析液中。
（3） 用玻璃棒將透析袋固定在燒杯內(nèi)，防止透析袋隨透析液旋轉(zhuǎn)而影響透析效果。4℃透析，2小時(shí)后更換透析液，透析過(guò)夜。
3.2.10.電泳檢測(cè)
裝載、流動(dòng)、洗滌、梯度洗脫蛋白各20μL，加入等量的2×SDS緩沖液，在沸水中煮沸8分鐘，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。常溫過(guò)夜染色，為避免染色過(guò)程中污染，染色液只回收一次。
4.蛋白質(zhì)濃度測(cè)定
每一種純化的蛋白質(zhì)在儲(chǔ)存前必須經(jīng)過(guò)處理
蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法如下：
取5毫升考馬斯亮藍(lán)G-250在試管中，加入100μl 0.9% NaCl的空白對(duì)照，加入適量的待測(cè)組（直到考馬斯亮藍(lán)G-250轉(zhuǎn)為棕紅色至藍(lán)色）的未知蛋白，用0.9%配制100μl的NaCl，攪拌均勻，靜置5分鐘，測(cè)定吸光度595。用721分光光度計(jì)（需預(yù)熱20分鐘）（玻璃比色皿，空白對(duì)照調(diào)為0），進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蛋白質(zhì)濃度。制作標(biāo)簽并在-20°C下儲(chǔ)存。5.濃縮蛋白
如果純化后的蛋白質(zhì)濃度過(guò)低，用超濾杯或硫酸銨沉淀法濃縮后再測(cè)定濃度。
1超濾杯的使用
使用前用三杯蒸餾水沖洗超濾杯三次，然后將三杯蒸餾水加入超濾杯中，以3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以徹底清洗濾膜。倒出三份蒸餾水，加入待濃縮的蛋白質(zhì)樣品，離心轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分，達(dá)到要求體積后停止離心，取出濃縮蛋白樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)和蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。超濾杯在使用前用三次蒸餾水沖洗三次。加入三杯蒸餾水，以3000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘。最后加入20%乙醇，將濾膜浸入乙醇中并在4℃下保存。
2硫酸銨沉淀法
將蛋白質(zhì)溶液與飽和硫酸銨按1:1的比例混合，置于4°C下30分鐘，以13000 rpm離心10分鐘，丟棄上清液，用500μL PBS溶解沉淀的蛋白質(zhì)（PBS的量可根據(jù)沉淀量適當(dāng)增加）。溶解后，透析液用于透析。

三，His-Tag重組蛋白親和層析注意事項(xiàng)
1在4°C下儲(chǔ)存的純化液每次使用前必須脫氣40分鐘，以防止在純化過(guò)程中凝膠進(jìn)入。
2加載前，應(yīng)使用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾樣品。
3每種蛋白質(zhì)都有其獨(dú)特的特性。如果緩沖液中的任何條件（pH值、鹽離子組成、鹽離子濃度）不合適，則蛋白質(zhì)沉淀緩沖液中各組分的濃度都不是恒定的?？筛鶕?jù)不同蛋白質(zhì)的特性進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整.