細(xì)胞軌跡分析是常見的單細(xì)胞數(shù)據(jù)下游分析，根據(jù)細(xì)胞的表達(dá)情況對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行排序，進(jìn)而模擬預(yù)測(cè)出細(xì)胞的動(dòng)態(tài)發(fā)育變化。常見的軌跡分析方法有擬時(shí)序分析（monocle2/monocle3）和RNA速率分析（RNAVelocity），但由于單細(xì)胞數(shù)據(jù)的復(fù)雜性，以及科研需求的個(gè)性化，各有優(yōu)劣的上百種軟件，到底哪一個(gè)才能更好的闡明實(shí)驗(yàn)結(jié)果？這里為大家推薦一款非常適合關(guān)注線性單細(xì)胞譜系發(fā)育的軟件--- 天蝎座 SCORPIUS，各位老師一起來(lái)看看吧！

1.SCORPIUS原理簡(jiǎn)介

SCORPIUS是一款R包，通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)推測(cè)細(xì)胞的線性發(fā)育過(guò)程。預(yù)印本發(fā)表鏈接是：SCORPIUS improves trajectory inference and identifies novel modules in dendritic cell development ，目前已有 67次引用。分析中，軟件主要通過(guò)3步計(jì)算來(lái)預(yù)測(cè)細(xì)胞的發(fā)育軌跡：

圖1 | 預(yù)測(cè)細(xì)胞發(fā)育軌跡

1.降維重聚類：計(jì)算相關(guān)距離，過(guò)濾掉離域值后多維縮放（spearman）；

2.計(jì)算通過(guò) k 個(gè)聚類中心的最短路徑，并使用主曲線算法迭代地將該路徑擬合到數(shù)據(jù)，創(chuàng)建初始路徑（principal_curve），并預(yù)測(cè)主曲線輸出的細(xì)胞排序；

3.特征選擇過(guò)程中，使用表達(dá)數(shù)據(jù)訓(xùn)練隨機(jī)森林，計(jì)算每個(gè)基因的重要性。

最后，再根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的假時(shí)間，以及篩選到的重要基因，對(duì)結(jié)果進(jìn)行匯總，并展示出不同條件下細(xì)胞沿假時(shí)間的發(fā)育情況。

2.SCORPIUS分析方法

2.1降維聚類和假時(shí)間預(yù)測(cè)

首先從上游單細(xì)胞分析數(shù)據(jù)（RDS/h5seurat）提取表達(dá)信息，計(jì)算細(xì)胞間的相關(guān)距離（spearman），以及簇中心之間的euclidean距離?；谶@個(gè)結(jié)果，我們可以進(jìn)一步找到連接所有聚類中心的最短路徑。

降維聚類和每個(gè)細(xì)胞的排序?qū)?huì)以圖表的結(jié)果提供。部分示例見表1：time為細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的假時(shí)間排序（0~1），comp1~3 為縮放后細(xì)胞的空間位置。預(yù)測(cè)的線性發(fā)育時(shí)間也可以根據(jù)實(shí)際細(xì)胞類型或分組進(jìn)行調(diào)整。

表1 | 細(xì)胞降維聚類和初始軌跡時(shí)間結(jié)果

2.2 篩選重要基因

其次，軟件采用隨機(jī)森林方法，計(jì)算并篩選出最重要基因，然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行BH矯正，獲得在時(shí)間變化過(guò)程中的重要基因列表，后面將在可視化熱圖中展示。

表2|?篩選得到的重要基因表格

2.3 可視化繪圖

最后，根據(jù)上一步篩選得到的重要基因，結(jié)合假時(shí)間趨勢(shì)，以熱圖的形式展示出細(xì)胞的發(fā)育變化。我們也可提供自己感興趣的基因單獨(dú)展示，比如梯度發(fā)育階段表達(dá)變化較大的基因，或者多種細(xì)胞類型的marker基因。

圖2 | UMAP展示假時(shí)間變化趨勢(shì)

圖3 | 多維縮放后細(xì)胞空間位置

圖4 | 重要基因、指定基因假時(shí)間趨勢(shì)熱圖

而后，作者也在多種數(shù)據(jù)中對(duì)該軟件進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果都比較理想，說(shuō)明該軟件在單細(xì)胞的空間位置分布，以及細(xì)胞的軌跡預(yù)測(cè)，進(jìn)而拓展至細(xì)胞的發(fā)育、分化或者復(fù)雜代謝背景的細(xì)胞功能識(shí)別中，都有較廣泛的適用性。

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