續(xù)

之前小編給大家分享了文章的總論和部分各論《Nature：激酶正成為炎癥和自身免疫病熱門靶點(diǎn)（一）| 鷹谷靶點(diǎn)》，下面把剩下的各論也拋磚引玉地分享給大家。

ITK和BTK

TEC家族是表達(dá)在胞內(nèi)的非受體蛋白酪氨酸激酶，家族成員有BTK、ITK/TSK/EMT、TEC、TXK和BMX，其結(jié)構(gòu)具有高度同源性。TEC激酶家族主要在造血細(xì)胞中表達(dá)，在白細(xì)胞的發(fā)育和功能中具有重要的作用。其中，BTK和ITK是具有吸引力的藥物靶點(diǎn)。BTK能夠調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞中的Fcε受體(FcεR)信號傳導(dǎo)，參與到IgE介導(dǎo)的疾病，如過敏、哮喘和特異反應(yīng)性皮炎等。在T細(xì)胞中，ITK能夠正向調(diào)節(jié)TCR信號通路，誘導(dǎo)IL-2、IL-4和IL-13的生成。當(dāng)肽-MHC與同源TCR結(jié)合時(shí)，ITK能夠被酪氨酸蛋白激酶LCK直接磷酸化，隨后進(jìn)行自磷酸化。ITK通過兩個(gè)SRC同源域SH2和SH3，和LAT-SLP76復(fù)合物建立聯(lián)系，創(chuàng)建一個(gè)依賴上游LCK和Zap70的復(fù)合物。接下來ITK能夠磷酸化磷脂酶Cγ?(PLCγ)，后續(xù)PLCγ剪切磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)，產(chǎn)生第二信使三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DAG)。IP3和DAG主要激活NFAT和鈣信號，靶向激活基因啟動子，如IL-2、IL-4和IL-13。目前JTE-051是唯一的ITK抑制劑，已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，評價(jià)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病的治療效果(NCT03358290)。

BTK通過BCR信號通路調(diào)控B細(xì)胞的發(fā)育。突變失活的BTK能夠抑制B細(xì)胞的發(fā)育，導(dǎo)致X連鎖無丙種球蛋白血癥。BTK能夠正向調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞中的FcεR信號，并且能夠正向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞中的FcγR信號，來傳遞免疫復(fù)合物。TLR誘導(dǎo)的B細(xì)胞分化和增殖依賴于BTK。在B細(xì)胞中，BCR激活后將ITAM暴露給LYN/SYK/BTK，進(jìn)而激活PLCγ2和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)?；罨腜LCγ2和PI3K進(jìn)而激活鈣離子介導(dǎo)的信號通路，從而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，例如NFAT和NF-κB，這些信號通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和細(xì)胞因子表達(dá)。

有幾種BTK抑制劑已經(jīng)進(jìn)入了臨床研究，在治療復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化癥的臨床II期研究中，Evobrutinib在使用3個(gè)月后能夠減小腦損傷斑塊。Branebrutinib（BMS-986195）已進(jìn)入到治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床研究。Fenebrutinib（GDC-0853）聯(lián)合甲氨蝶呤，能夠減輕對于TNF治療無反應(yīng)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的癥狀。PRN1008是一種新型可逆共價(jià)BTK抑制劑，已在治療天皰瘡的II期研究中顯示出較好的結(jié)果(NCT02704429)，并且正在全球范圍內(nèi)的臨床III期進(jìn)行進(jìn)一步的研究(NCT03762265)。BTK共價(jià)抑制劑通常會抑制RLK、ITK和TEC等激酶的活性。雖然脫靶效應(yīng)通常被認(rèn)為是增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，但在某些特定的病例中卻顯示脫靶效應(yīng)是有益的。因此評估共價(jià)或可逆BTK抑制劑其他的臨床數(shù)據(jù)有助于我們更好地研究不同細(xì)胞類型中BTK的功能，來確定藥物的最佳和最安全的治療方案。鑒于BTK在炎癥中的不確定性作用，可以考慮BTK抑制劑和其他抗炎藥物聯(lián)合使用，探索治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。BTK抑制劑也正在探索治療COVID-19重癥感染病人的細(xì)胞因子風(fēng)暴；臨床前研究和一些病例表明BTK抑制劑Ibrutinib能夠?qū)?yán)重肺損傷有保護(hù)作用。

SYK是Src家族成員，在FcR和BCR信號通路中有很重要的作用，在TCR信號通路中，SYK的功能和其同源的酪氨酸蛋白激酶Zap70是一致的，因此SYK是治療慢性炎癥和自身免疫病的很好的藥物靶點(diǎn)。SYK包含兩個(gè)SH2域，C端激酶域分別由接頭A和B連接。這些Linker綁定在一起，使得SH2域處于穩(wěn)定的失活狀態(tài)。受體激活后導(dǎo)致SH2結(jié)構(gòu)域的釋放和自磷酸化，進(jìn)而與ITAMs1進(jìn)行對接。SYK的進(jìn)一步磷酸化導(dǎo)致它與ITAMs分離并激活相關(guān)的其他信號通路。SYK在各種免疫相關(guān)通路中發(fā)揮著重要作用，包括PI3K-AKT、Ras-ERK、PLCγ-NFAT、VAV1-Rac和IKK-NF-κB通路。因此，靶向SYK會影響SYK調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路的細(xì)胞生命過程，如吞噬作用、細(xì)胞因子產(chǎn)生、脫顆粒、增殖、B細(xì)胞成熟、破骨細(xì)胞生成和血小板活化。

由Rigel Pharmaceuticals公司研發(fā)的多個(gè)SYK小分子抑制劑已進(jìn)入了臨床研究。R406（及其前藥R788和osTAMatinib）在小鼠中顯示出預(yù)防關(guān)節(jié)炎的功效。在臨床試驗(yàn)中，和TNF抑制劑這樣的抗炎藥相比，盡管效果不及TNF抑制劑，但R406和R788仍顯示出治療關(guān)節(jié)炎的中等效果。FosTAMatinib目前已獲批用于治療免疫血栓血小板減少性紫癜。

MAPK: TPL2, p38γ, p38δ and ERK5

MAPKs是一個(gè)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，參與應(yīng)激、炎癥、增殖、分化、存活、細(xì)胞凋亡等過程。MAPKs是很多免疫受體和細(xì)胞因子受體的下游，如TLRs、IL-1R、TNFR、CSF1R和IL-17R，EGF、FGF和VEGF。p38α/β、MEK1/2和ERK1/2等主要的幾個(gè)MAPKs的抑制劑已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)。一些組織細(xì)胞特異性的MAPK激酶在炎癥反應(yīng)中起主要的作用，如TPL2、p38γ和p38δ。下面我們對每一種激酶進(jìn)行簡單介紹。

TPL2能夠被多種受體激活，包括TNFR、IL-1R、TLR、CD40R、IL-17R和Gαi2轉(zhuǎn)導(dǎo)的GPCR信號。在穩(wěn)定的狀態(tài)下，TPL2能夠與A20結(jié)合NF- κB抑制子(ABIN2)和胞內(nèi)NF-κB1小片段形成復(fù)合物。TPL2的激酶結(jié)構(gòu)域與p105死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，這種相互作用阻斷了底物與TPL2活性區(qū)域相結(jié)合。全長p105蛋白是一個(gè)REL蛋白特異性轉(zhuǎn)錄抑制子，而其加工后的形式是一個(gè)50 kDa蛋白(p50)，NF- κB復(fù)合物的亞基。在受體接收到配體的信號后，IKKβ在Ser927和Ser932兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化p105，導(dǎo)致其降解。隨后，TPL2從復(fù)合物中釋放出來，然后自磷酸化或反式磷酸化并激活底物MEK1和MEK2，還有MEK3和MEK6，調(diào)節(jié)ERK1和ERK2、p38α和p38δ在炎癥中的作用。

Tpl2缺陷的小鼠能夠避免遭受多種炎癥炎癥和自身免疫性疾病。對表達(dá)點(diǎn)突變失活的TPL2(D270A)小鼠進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中ABIN2表達(dá)未發(fā)生改變，表明TPL2通過正向調(diào)節(jié)MAPK，介導(dǎo)TNFR、TLR和IL-R信號通路。當(dāng)用TLR激動劑(如LPS)的刺激小鼠后，這些小鼠產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子明顯減少，且展現(xiàn)出較少的免疫細(xì)胞浸潤。在分子水平上，TPL2不僅僅能夠激活MEK1和MEK2，而且還能激活p38γ和p38δ。特異性和安全性依然是針對TPL2研發(fā)的藥物中需要面對的問題，吉利德已經(jīng)將它的TPL2抑制劑(GS-4875)推進(jìn)到了臨床研究，目的是治療潰瘍性結(jié)腸炎。

P38α、p38β、p38γ和p38δ是只在哺乳動物組織中表達(dá)的4種亞型。p38的激活依賴于細(xì)胞類型特異性、受體特異性和信號強(qiáng)度特異性。所有的p38家庭成員共享Thr- Gly- Tyr (TGY)活化基序，這個(gè)基序是能夠被MKK3和MKK6(一些情況下是MKK4)雙重磷酸化。P38α和p38β已被大家深入的了解，但對p38γ和p38δ知之甚少。p38γ(也稱為ERK6、SAPK3或MAPK12)與p38δ(也稱為SAPK4或MAPK13)具有70%的同源性，兩者有別于p38α(約60%的同源性)。p38γ和p38δ在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中能夠調(diào)節(jié)TPL2的穩(wěn)定性。由于TPL2-ABIN2信號需要LPS誘導(dǎo)的TNF和IL-1β生成，因此缺乏p38γ或p38δ的小鼠對感染性休克和LPS誘導(dǎo)的肝炎敏感性較低。

有幾種p38的抑制劑已經(jīng)進(jìn)入了臨床研究。然而，大多數(shù)p38抑制劑的靶點(diǎn)為p38α和p38β，缺乏抑制p38γ和p38δ的活性。p38α/β的靶向抑制劑由于其毒性、對各種細(xì)胞類型的多效性，在動物模型中可預(yù)測性差等因素，其效果不是很成功。最近，報(bào)道了一種特異性的p38α抑制劑CDD-450，能夠選擇性阻斷促炎激酶MK2對p38α的活化。CDD-450能夠促進(jìn)IL1B、TNF、IL-6、mRNA的降解來緩解大鼠的關(guān)節(jié)炎。RV56是一款靶向p38α和p38γ的抑制劑，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)小鼠COPD肺氣腫模型中均能夠有效抑制炎癥反應(yīng)。

ERK5(也稱為MAPK7)是一種細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的MAPK，能夠被MEKK2、MEKK3和MEK5激活。ERK5位于細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)受體的下游，免疫受體如TLRs、IL-1R、TNFR或IL-17R，CSF1R和生長因子受體如EGF、FGF或VEGF。在這些受體中，CSF1R信號通路因其在巨噬細(xì)胞分化及其在腫瘤和炎癥中的重要作用，成為了大家關(guān)注的焦點(diǎn)。一些CSF1R抑制劑(PLX-3397、JNJ-40346527、ARRY-382、ABT-869、BLZ-945)已經(jīng)進(jìn)入到到臨床試驗(yàn)。ERK5的激酶域位于蛋白質(zhì)的N端，并與ERK2激酶域同源。與其他MAPKs相比，ERK5具有獨(dú)特的C端轉(zhuǎn)錄激活域。因此，ERK5不僅可以通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，還可以作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄共同因子來激活轉(zhuǎn)錄。

ERK5激酶活性在調(diào)節(jié)炎癥方面的作用是有爭議的。一項(xiàng)研究表明ERK5激酶能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的生成和免疫細(xì)胞的招募，但這一結(jié)果受到了質(zhì)疑，這種效應(yīng)被歸因于在生化和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中BET bromodomain的脫靶效應(yīng)。有兩個(gè)研究表明在上皮細(xì)胞中和人原代血管內(nèi)皮細(xì)胞中敲低ERK5，能夠減少炎癥細(xì)胞因子的生成。這些數(shù)據(jù)提示ERK5的非催化活性能夠正向調(diào)控炎癥反應(yīng)。在角質(zhì)細(xì)胞有ERK5缺陷的小鼠中，ERK5被證明是參與皮膚炎癥發(fā)生的重要組成部分。由于ERK5參與比較多的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)，包括作為激酶或轉(zhuǎn)錄因子的作用，敲除ERK5研究結(jié)果可能抑制其激酶活性。不過目前來說，用ERK5抑制劑對小鼠進(jìn)行持續(xù)時(shí)間內(nèi)的給藥是可行的。但ERK5抑制劑的選擇性需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

TBK1和IKKε

TBK1及其同源蛋白IKKε屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它們能夠通過激活I(lǐng)RFs誘導(dǎo)I型干擾素基因和干擾素刺激基因(ISGs)的表達(dá)，該機(jī)制參與了某些自身炎癥或自身免疫病，如干擾素介導(dǎo)的相關(guān)疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相比，干擾素介導(dǎo)的相關(guān)疾病包括以干擾素介導(dǎo)的免疫穩(wěn)態(tài)失衡為特征的單基因遺傳病。這些疾病包括伴發(fā)基底核鈣化的腦病、家族性凍瘡狼瘡、脊椎軟骨發(fā)育不良，干擾素刺激基因15 (ISG15)的缺失等。

TBK1和IKKε能夠調(diào)節(jié)許多固有免疫受體，包括TLRs、RIG-I-樣受體和STING。鑒于TBK1和IKKε在I型干擾素的生成中起到重要的作用，TBK1和IKKε都是很熱門的藥物靶點(diǎn)。突變TBK1能夠?qū)е轮袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病，如肌萎縮側(cè)索硬化癥，部分原因是干擾素信號通路異常導(dǎo)致的。多個(gè)TBK抑制劑目前主要在臨床前階段，包括BX795(Amgen)、MRT67307、(類似于BX795，其選擇性更強(qiáng))，AZ13102909(阿斯利康)、Domainex TBK1抑制劑、Myrexis MPI-0485520和化合物II(德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心)。最后一種是amlexanox，被FDA批準(zhǔn)治療復(fù)發(fā)性口瘡性潰瘍和哮喘，其機(jī)制是抑制TBK1和IKKε，但其選擇性較差。由于這兩個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域高度同源，導(dǎo)致選擇性IKKε或TBK1抑制劑的開發(fā)具有較大的難度。目前IKKε或TBK1抑制劑在干擾素介導(dǎo)的相關(guān)疾病臨床前模型和小鼠神經(jīng)炎癥模型提示，在某些自身免疫或自身炎癥性疾病中，靶向IKKε和TBK1是安全且有效的。

NIK

NIK是非經(jīng)典NF-κB信號通路中的重要組成部分，處于TNFR超家族成員的下游，其成員包括BAFF、CD40、TWEAK、RANK、TNFR2、FN14、CD27、CD30和OX40等。NIK缺陷導(dǎo)致免疫缺陷綜合征并伴有B細(xì)胞淋巴細(xì)胞減少，記憶B細(xì)胞分化減少，自然殺傷細(xì)胞發(fā)育異常，以及T細(xì)胞功能異常。NIK突變的小鼠，會出現(xiàn)淋巴結(jié)紊亂，派爾斑，脾臟和胸腺結(jié)構(gòu)導(dǎo)致B細(xì)胞數(shù)量和免疫球蛋白減少等癥狀。成年小鼠Map3k14的敲除再現(xiàn)了B細(xì)胞在胚系中的作用。來自Map3k14敲除小鼠的B細(xì)胞對BAFF刺激沒有反應(yīng)，這個(gè)結(jié)果支持了NIK在BAFF受體信號通路中的作用。有趣的是，T細(xì)胞Map3k14缺失顯示NIK在T細(xì)胞中的非冗余功能。NIK的激活部分受到復(fù)雜機(jī)制的調(diào)控，這些復(fù)雜機(jī)制是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在穩(wěn)定狀態(tài)下，NIK蛋白水平較低，因?yàn)镹IK容易通過包括TRAF3、TRAF2和IAP1/2的泛素連接酶復(fù)合物被蛋白酶體降解。當(dāng)非經(jīng)典NF-κB通路被激活時(shí)，NIK激活I(lǐng)KKα，IKKα能夠調(diào)節(jié)NF-κB p100到p52。p52與RelB二聚化，復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核觸發(fā)靶基因的轉(zhuǎn)錄。

廣泛性抑制NF- κB活性難以提供一個(gè)有效的治療，其原因在于在生物過程中NF- κB信號通路參與多種生理過程的調(diào)節(jié)。然而，抑制像NIK這樣的免疫調(diào)節(jié)的節(jié)點(diǎn)能夠在治療非經(jīng)典NF- κB信號通路異常激活的的疾病中，提供一個(gè)合理的治療方法。如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、IgA腎病、代謝綜合征及多發(fā)性硬化癥等。用NIK抑制劑抑制NIK活性能夠發(fā)現(xiàn)，NIK激酶能夠調(diào)節(jié)一些重要途徑，如BAFF、OX40、CD40、誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激因子(ICOS)、IL-21和TNFRSF12A(也稱為TWEAK受體)信號通路，并且抑制NIK在臨床前狼瘡模型中具有保護(hù)作用。

在臨床研究方面，Belimumab是一種批準(zhǔn)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物。一些調(diào)節(jié)抗體或融合蛋白，抗CD40(CFZ533 (NCT02291029)、leselumab (NCT01585233)、I-655064 (NCT03385564)、FFP104(NCT02465944))、抗CD40L (dapirolizumab (NCT02804763)和letolizumab (NCT02273960))目前正在研究中，用于治療各種疾病，如銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、免疫血栓血小板減少性紫癜、原發(fā)性膽汁性肝硬化和器官移植。

CDK8 和?CDK19

CDK8和CDK19(兩者有97%蛋白同源性)主要調(diào)控RNA聚合酶II(RNAP II)的活性。一些CDK分子(CDK1、CDK2、CDK4、CDK6)和相對應(yīng)的cyclins直接參與細(xì)胞周期調(diào)控。在一些腫瘤中發(fā)現(xiàn)CDK8或CDK19是高表達(dá)狀態(tài)，靶向CDK8和CDK19的抑制劑也已被開發(fā)，如Cortistatin A、Senexin A、CCT251921、MSC2530818和BRD6989。之前大多數(shù)的研究主要集中在CDK8和CDK19的致癌機(jī)制方面，而新的數(shù)據(jù)表明CDK8和CDK19也可能參與細(xì)胞重編程過程。在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，BRD6989（CDK8和CDK19的雙靶點(diǎn)抑制劑）能夠通過增強(qiáng)AP-1的活性上調(diào)IL-10的生成，這表明CDK8和CDK19參與先天免疫過程。

兩項(xiàng)獨(dú)立的研究證明抑制CDK8和CDK19的抑制劑能夠促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化。Akamatsu等人用約5000個(gè)不同母核的抑制劑進(jìn)行功能性篩選，以評估其對不成熟 CD4+ T細(xì)胞分化為FOXP3+ Treg細(xì)胞的影響。結(jié)果表明CDK8和CDK19通過TGFβ非依賴途徑，激活STAT5，正向調(diào)控FOXP3的表達(dá)。在臨床前自身免疫性腦脊髓炎和非肥胖糖尿病模型中，體內(nèi)抑制CDK8和CDK19的活性能夠促進(jìn)抗原特異性Treg細(xì)胞的發(fā)育，緩解自身免疫病的癥狀。在另一項(xiàng)研究中，Guo等人使用了CDK8和CDK19抑制劑(CCT251921或Senexin A)增強(qiáng)TGFβ信號傳導(dǎo)，促進(jìn)Treg細(xì)胞分化。越來越多的研究表明，CDK8和CDK19抑制劑可能是誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化的有力工具，適用于體外Treg細(xì)胞治療。然而，鑒于激酶在其他類型的細(xì)胞中也具有重要的功能，這些抑制劑的長期服用可能會有潛在安全風(fēng)險(xiǎn)。

結(jié)語

和免疫性疾病相關(guān)的小分子激酶抑制劑的研發(fā)已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展，如JAKs、TYK2、IRAK4、BTK、SYK、RIPs和TPL2等激酶抑制劑，針對這些靶點(diǎn)的藥物很多已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)。這些藥物能夠靶向多個(gè)免疫相關(guān)的信號通路，這些信號通路是研究免疫疾病機(jī)制的關(guān)鍵線索，能夠讓科學(xué)家更好地針對信號通路中的不同靶點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物。激酶抑制劑的設(shè)計(jì)是具有選擇性的，且有最小的脫靶效應(yīng)，通常以靶向激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)作為激酶抑制劑設(shè)計(jì)的主要思路。然而，ATP結(jié)合位點(diǎn)相對保守，改造性差，因此選擇性較好的激酶抑制劑設(shè)計(jì)思路是關(guān)鍵。目前共價(jià)抑制劑和變構(gòu)抑制劑的設(shè)計(jì)逐漸成為小分子激酶抑制劑藥物設(shè)計(jì)的主要方向。此外，生物信息學(xué)、人工智能結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)可以進(jìn)一步挖掘化合物的構(gòu)效信息，加快對化合物信息的提取和篩選。未來的治療狀態(tài)可能是靶向多個(gè)靶點(diǎn)的小分子藥物聯(lián)合使用，能夠緩解免疫疾病的癥狀，且將副作用降為最低。

參考文獻(xiàn)：

Zarrin AA, Bao K, Lupardus P, Vucic D. Kinase inhibition in autoimmunity and inflammation. Nat Rev Drug Discov. 2021 Jan;20(1):39-63. doi: 10.1038/s41573-020-0082-8. Epub 2020 Oct 19. PMID: 33077936; PMCID: PMC7569567.