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• 題目：基于機器學習的肝癌雙硫死亡相關鐵死亡評分的開發(fā)和實驗驗證

• 雜志：Apoptosis

• 影響因子：IF=7.2

• 發(fā)表時間：2023年10月? ? ? ?

  公眾號回復“123”獲取文獻，文獻編號：231117??

研究背景

雙硫死亡和鐵死亡是兩種不同的程序性細胞死亡途徑。雙硫死亡是由細胞內過量胱氨酸積累引起的二硫化物應激的快速死亡方式。鐵死亡是一種鐵離子依賴的過量脂質過氧化積累導致的細胞功能異常及最終完成破裂的死亡方式。由于它們作為治療靶點的潛力，已經引起了相當大的關注，但與雙硫死亡相關的鐵死亡基因在肝細胞癌(HCC)中的作用仍不清楚。

數據來源

研究思路

基于TCGA-LIHC隊列，本研究采用Pearson相關性分析來檢驗雙硫死亡相關基因與鐵死亡相關基因之間的相關性。使用“l(fā)imma”包分析肝癌和正常組織中與雙硫死亡相關的鐵死亡基因的差異表達。采用單因素Cox回歸分析，確定與預后相關的候選基因。使用了兩種不同的機器學習算法（lasso-cox回歸算法和ranger算法）構建預后模型。對交集的4個關鍵基因進行基于bootstrap的多元Cox回歸分析。通過ICGC與GEO外部肝癌隊列對預后模型進行驗證。使用“clusterProfiler”和“ReactomePA”包進行基因集富集分析(GSEA)。通過6種免疫浸潤算法(CIBERSORT、EPIC、MCPCounter、quanTIseq、TIMER、xCell)，評估TCGA數據庫中HCC患者的免疫浸潤程度。利用TIDE算法預測免疫治療的反應性。使用“oncopdict”包計算來自GDSC數據庫的藥物估算敏感性評分。通過“Seurat”包分析scRNA-seq數據集，采用KNN算法進行細胞聚類。此外，使用“irGSEA”和“UCell”包對不同細胞類型相關的通路進行富集分析。最后，進行體外實驗來驗證KIF20A的功能。? ??

主要結果

1. 肝癌中與雙硫死亡基因相關的鐵死亡基因評分的鑒定與構建

本研究利用Pearson相關性分析鑒定出180個與雙硫死亡相關的鐵死亡差異表達基因，對這180個基因進行單因素Cox回歸分析，得到105個顯著基因，圖1A顯示了前20個與雙硫死亡相關的預后顯著的鐵死亡基因。為了識別與雙硫死亡相關的核心鐵死亡基因，本研究使用了兩種不同的機器學習算法，lasso-cox回歸算法和ranger算法。通過lasso-cox算法，105個基因中有12個被鑒定出來(圖1B, C)。SWSFS算法鑒定出7個最重要的基因(圖1D)。把lasso和ranger算法濾出基因進行交叉，確定四個候選基因作為與雙硫死亡基因相關的鐵死亡基因，并來構建與雙硫死亡基因相關的鐵死亡基因（DRF）評分(圖1E)。基于bootstrap的多變量Cox回歸建立模型，評估生存分析的準確性和穩(wěn)健性(圖1F)。

圖1 核心雙硫死亡相關鐵死亡基因的鑒定和DRF評分的構建

2. 驗證DRF評分的預后價值

接下來本研究對DRF評分進行了評估和驗證。生存曲線結果發(fā)現(xiàn)，DRF評分較高的患者總生存期(OS)較短，死亡率較高(圖2A)。為了證明DRF評分的穩(wěn)定性和可靠性，使用ICGC-LIRI-JP和GSE14520隊列作為外部驗證隊列。同樣，DRF評分高的患者生存率低于DRF評分低的患者(圖2B, C)。本研究使用其他三個預后指標(DSS、PFI、DFI)來評估DRF評分對HCC的預后價值。結果顯示，高評分組預后較低評分組差(圖2D-F)。此外，應用ROC曲線來評估DRF評分的準確性。對于TCGA-LIHC隊列，1年、2年、3年和4年生存率的AUC值分別為0.804、0.714、0.700和0.688(圖2G)。ICGC-LIRI-JP和GSE14520驗證隊列的ROC曲線也顯示了DRF評分的預測性能(所有AUC > 0.600，圖2H, 1)。

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圖2 在內部和外部隊列中驗證DRF評分的生存率

3.?生物學功能及途徑分析

為了探索不同群體中潛在的分子特征，本研究通過GSEA評估其潛在的生物學功能。GSEA結果顯示，GO主要富集在細胞生長、增殖和發(fā)育調控途徑中(圖3A)。KEGG通路在細胞周期、DNA復制、錯配修復等過程中富集(圖3B)?；赗eactome數據集的結果與上述結果一致(圖3C)。本研究還在高和低評分組之間進行了GSVA功能富集分析，以進一步確定顯著富集的激活途徑。KEGG通路、Reactome通路和50個標志基因集的GSVA結果也表明，細胞生長、增殖和發(fā)育調控通路，在高評分組中富集(圖3D, E)。這些結果提示，DRF評分可能與細胞增殖和分裂有關，并可能通過影響腫瘤細胞的細胞周期來影響細胞的存活。? ??

圖3 生物學功能及途徑分析

4.?不同組腫瘤免疫微環(huán)境景觀

為了確定DRF評分與免疫應答之間的關聯(lián)，本研究共使用了6種算法(CIBERSORT、EPIC、MCPCOUNTER、QUANTISEQ、TIMER、XCELL)計算了DRF評分、KIF20A、G6PD、SLC7A11、SLC2A1與不同免疫細胞的相關性，明確了DRF評分與免疫細胞的相關性(圖4A)。結果顯示，DRF評分、KIF20A、G6PD、SLC7A11與大部分免疫抑制細胞呈正相關，與部分免疫活化細胞呈負相關。此外，進一步使用6種免疫浸潤算法計算高分組和低分組之間免疫細胞的差異(圖4B)。同樣，得分越高，免疫抑制細胞的比例越高(圖4C, D)。這些結果表明，得分高的組可能與促進腫瘤存活的免疫微環(huán)境有關。

圖4 不同組腫瘤免疫微環(huán)境景觀

5.?DRF評分與免疫檢查點和突變負荷的關系

本研究接下來探索了DRF評分與許多免疫檢查點之間的聯(lián)系。結果顯示DRF評分與各種免疫檢查點基因呈正相關(圖5B)。進一步分析了這些免疫檢查點基因在低和高評分組中的分布。發(fā)現(xiàn)大多數免疫檢查點在兩個不同DRF評分組中具有統(tǒng)計學差異(圖5A)。本研究使用了TIDE算法評估免疫治療在低評分組和高評分組的潛在臨床效果，結果顯示，低評分組患者對免疫治療的應答率較高，DRF評分與TIDE評分呈正相關 (圖5C-E)。此外，高評分組T細胞排斥評分較高，表明高評分組細胞毒性T淋巴細胞浸潤較少(圖5F)。接下來，分析了高分組和低分組的突變情況，TP53、DNAH10、MCTP2、DIP2C、NLRP2和RB1在高評分組的突變率遠高于低評分組(圖5I)。這些發(fā)現(xiàn)強烈表明，DRF評分與TME細胞浸潤和體細胞突變有關。

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圖5 DRF評分與免疫檢查點和突變負荷的關系

6.?DRF評分在預測TACE和藥物治療反應方面的表現(xiàn)

TACE是肝癌中期患者的一線治療方案。本研究發(fā)現(xiàn)，對TACE有反應的患者的DRF評分值顯著低于無反應的患者(圖6A, B)。此外，DRF評分預測HCC患者對TACE無反應的AUC值為0.756(圖6C)。為了評估DRF評分對肝癌藥物治療的預測作用，使用R軟件包“oncoPredict”在多個數據集中比較了高危組和低危組的藥物IC50分布。結果顯示，高危組對多西他賽、紫杉醇等常用化療藥物和阿法替尼、依魯替尼等分子靶向藥物更為敏感(圖6D-O)。這些結果表明，DRF評分可以預測TACE、化療和靶向治療的療效。

?圖6 DRF評分在預測TACE和藥物治療反應方面的表現(xiàn)

7.單細胞測序數據中細胞定位和通路富集分析

為了研究模型中四個基因在不同細胞類型中的表達和DRF評分，本研究進行了單細胞測序分析。首先，利用KNN算法將所有細胞分成32個簇，根據不同細胞類型表面標記物的表達情況，鑒定出7種不同的細胞類型(圖7A)。接下來，特征圖結果顯示，KIF20A、G6PD、SLC7A11、SLC2A1主要在腫瘤細胞中表達(圖7B-E)。此外，不僅腫瘤細胞有較高的DRF評分，巨噬細胞和T細胞也有較高的DRF評分(圖7F)。單細胞數據的通路富集分析顯示，DNA修復、E2F檢查點和P53通路主要在腫瘤細胞中上調(圖7G - I)。這一結果進一步表明，DRF評分可能通過改變參與細胞周期進程的基因的表達來影響腫瘤的生長。? ??

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圖7 在單細胞測序數據中檢測細胞分布和富集通路

8.?核心基因功能的體外實驗驗證

本研究選擇KIF20A作為代表基因，在體外實驗驗證DRF評分的影響。使用HPA和CPTAC數據庫對KIF20A的蛋白表達水平進行分析，結果顯示KIF20A在腫瘤組織中的表達明顯高于正常組織(圖8A, B)。本研究敲除KIF20A以確定KIF20A對細胞周期進程和細胞生長的影響。通過CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)，下調的KIF20A顯著抑制HCC細胞的生長(圖8C)。流式細胞術細胞周期分析顯示，KIF20A敲低導致G2/M停滯(圖8D)。為了進一步研究KIF20A的惡性生物學行為，采用基于CFSE的方法直接評估KIF20A對細胞增殖的影響。結果顯示，KIF20A敲低顯著降低了HCC細胞的增殖 (圖8E, F)。綜上所述，KIF20A在HCC組織中表達升高，KIF20A敲低導致G2/M阻滯和增殖阻斷。

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? ? ??? 圖8 核心基因功能的體外實驗驗證? ???????

文章小結

這篇文章可謂是緊跟當前研究潮流，選擇了雙硫死亡與鐵死亡這兩個熱點話題，直接吸人眼球！同時又使用了機器學習和單細胞測序這兩種當紅的研究方法。最后還在體外進行關鍵基因的生物學功能驗證，干濕結合，瞬間提升文章質量！創(chuàng)新內容加創(chuàng)新方法，讓這篇文章輕松拿下7分+。想蹭熱點話題的小伙伴們，不要錯過這個好思路，還可以拓展做國自然課題，一舉兩得~?想復現(xiàn)的小伙伴們快快掃碼聯(lián)系小云吧！? ?