WB是研究蛋白表達(dá)的一個(gè)經(jīng)典方法。對于一些時(shí)間點(diǎn)或者是不同組織蛋白表達(dá)量的分析就涉及到量的變化。一些凝膠成像軟件帶有此分析工具，比如Quantity One，Bandscan，Gel-Pro Analyzer等成像系統(tǒng)專用軟件。除了這些軟件，還有一個(gè)比較簡單的綜合性質(zhì)圖像處理軟件Image J可以很方便的進(jìn)行灰度分析。而且Image J是開源性質(zhì)的免費(fèi)軟件，可以在其官網(wǎng)直接下載使用。

對Western Blot條帶進(jìn)行數(shù)值化有兩種方法——灰度分析和光密度分析。灰度是計(jì)算機(jī)圖像分析儀根據(jù)圖像顏色深淺分為256個(gè)級(jí)別。灰度值越小物體顏色越深。光密度是指光線通過溶液或某一物質(zhì)前的入射光強(qiáng)度IO與該光線通過溶液或物質(zhì)后的透射光強(qiáng)度Ib比值的對數(shù)OD=log（IO/Ib）；圖像分析中，入射光和透射光強(qiáng)度分別被切片上最亮區(qū)域的平均灰度值和待測目標(biāo)平均灰度值取代，則圖像分析系統(tǒng)的光密度值=log（切片標(biāo)本最亮區(qū)域的平均灰度值（g0）/待測目標(biāo)的平均灰度值（g））。光密度值越大，物體顏色越深，陽性物質(zhì)相對含量越大。

對于灰度值來說，切片標(biāo)本制作時(shí)染色時(shí)間長短，以及測量時(shí)顯微鏡照明光源電壓的大小對其影響很大。而光密度是一個(gè)比值。是通過計(jì)算一張切片標(biāo)本最亮區(qū)域的平均灰度值與該切片標(biāo)本中待測目標(biāo)的平均灰度值的比值，再根據(jù)數(shù)學(xué)公式計(jì)算而來的，所以受切片標(biāo)本染色時(shí)間長短及照明光源電壓關(guān)系很小。

然而有研究實(shí)踐顯示，灰度值與光密度值二者之間存在著線性關(guān)系，都可以用來進(jìn)行WB定量分析。

????同樣，Image J軟件進(jìn)行WB條帶定量分析時(shí)也存在兩種方法，此處只列舉一種方法，具體步驟如下。

1、下載安裝，并打開Image J軟件。

2、導(dǎo)入WB條帶圖片。File→Open→ 彈出對話框→選擇文件夾→找到WB條帶。

3、把圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖片：Image→Type→8-bit。這時(shí)WB圖片將會(huì)隨之改變。

4、消除圖片背景的影響。Process→Subtract Background。在彈出的對話框中，填上50基本就可以了，也可以稍高些，并勾上Light background，點(diǎn)擊OK即可。此時(shí)圖片背景會(huì)變白一些。

5、設(shè)置定量參數(shù)。Analyze→Set Measurements。在彈出的對話框中勾選Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density。

6、設(shè)置單位。Analyze→Set Scale。在彈出的對話框“Unit of length”后面填上“pixels”，其他的不用改動(dòng)。

7、把WB圖片轉(zhuǎn)換成亮帶。Edit?→?Invert。

8、選擇菜單欄下的一系列不規(guī)則圓圈，根據(jù)情況選擇一種。然后將圓圈手動(dòng)拉倒第一條帶，并盡量將條帶都圈起來。

9、點(diǎn)擊菜單欄Analyze下拉出現(xiàn)的measurement，即可彈出你選定區(qū)域的灰度統(tǒng)計(jì)值。也可以點(diǎn)擊快捷鍵（英文狀態(tài)下的鍵盤m）。

10、手動(dòng)移動(dòng)不規(guī)則圓圈至下一條條帶，重復(fù)8、9步驟，直至所有條帶都被測量。

11、當(dāng)測定完所有條帶，選結(jié)果中的“Edit”的“Select All”，然后復(fù)制數(shù)據(jù)“IntDen”到Excel表即可進(jìn)行分析。也可以直接在Results對話框中，選擇File?→?Save as，直接導(dǎo)出excel表格。

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12、在excel表格中將目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值，進(jìn)行歸一化處理。

13、下載安裝，并打開Graphpad軟件。

14、在對話框左側(cè)欄目“New table & graph”下選擇“Column”。然后再右側(cè)選擇所要作的圖形，以及是否顯示誤差棒等，具體如下圖。

15、在彈出的表格中，填上excel中的比值。

16、然后點(diǎn)擊菜單欄上Insert → New Graph of Existing Data... 。也可以在工具欄Sheet中的“New”條目下找到。（其實(shí)這步可以省略）

17、在彈出的對話框“Create New Graph”中，填寫新圖名稱，選擇分析方法，圖形，以及誤差棒的表示方法，具體如下。（其實(shí)這步可以省略）

18、此時(shí)，可以在工具欄下左側(cè)的狀態(tài)欄“Graphs”文件夾中找到所建新圖“Date 1”。

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19、此時(shí)可以對圖形的外觀進(jìn)行修改，增加圖片題目以及XY軸名稱。直接在圖上對應(yīng)位置左鍵點(diǎn)擊修改。

20、也可以借助工具欄“Change”中的功能鍵對圖片的柱形圖顏色、寬度、高度、間隔等進(jìn)行調(diào)整。

21、然后點(diǎn)擊工具欄“Export”將新建的柱形圖導(dǎo)出。

22、上面只是單因素的柱狀圖構(gòu)建方法。如果是雙因素，應(yīng)該在一開始選擇“Column”時(shí)選擇“Grouped”。切記??！

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