針對SARS-CoV-2的藥物以在超大型化學(xué)文庫中尋找SARS-CoV-2主蛋白酶抑制劑。首先，基于結(jié)構(gòu)的對接用于篩選活性位點上2.35億種虛擬化合物的不同庫，對100種排名靠前的化合物進行了結(jié)合和酶測定。其次，對93種化合物進行片段檢測。在第一次文庫篩選中鑒定出3個抑制劑，其中5個所選片段顯示出抑制作用。靶點-抑制劑復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)證實了對接預(yù)測，并指導(dǎo)了對苗頭化合物的優(yōu)化，從而獲得了一種具有納摩爾親和力的非共價主蛋白酶抑制劑，具有良好的體外藥代動力學(xué)特征，并在感染細胞中具有廣譜抗病毒作用。

Mpro抑制劑的超大型庫對接

在第一個虛擬篩選中，2.35億個化合物被疊合在MPro的晶體結(jié)構(gòu)上，并與基于底物的抑制劑X77 (PDB : 6W63)確定配合物。X77是一種Mpro抑制劑，占據(jù)了活性位點的所有四個主要口袋(S1、S1’、S2和S3)(圖1)。

篩選的化學(xué)文庫由結(jié)構(gòu)多樣化的化合物組成，具有良好的物理化學(xué)性質(zhì)，是以前從未合成過的新化學(xué)結(jié)構(gòu)。在MPro活性位點對庫中的每個化合物進行了數(shù)千種構(gòu)象采樣，并使用DOCK3.7評分函數(shù)對總共>223萬億個復(fù)合物進行了評估。從3000個與X77形成相同氫鍵的頂級化合物中選擇了另外18個分子。在復(fù)合物選擇步驟中，同時也考慮了對接計分函數(shù)中未包含的對配體結(jié)合的貢獻。將化合物排除在實驗測試之外的原因包括配體應(yīng)變，結(jié)合位點殘基或化合物的極性原子不滿足，以及不可能的互變異構(gòu)/電離態(tài)。

兩種基于乙內(nèi)酰脲支架的抑制劑的晶體結(jié)合模式與通過分子對接獲得的預(yù)測配合物非常吻合，均方根偏差(rmsd)分別為0.6和1.4 A(圖3a,b)。乙內(nèi)酰脲羰基與殘基Gly143和Glu166形成氫鍵，乙內(nèi)酰脲核心上的取代基延伸到S2和S1口袋。根據(jù)對接得分，化合物1在化學(xué)庫中排名前0.002%，吡啶基乙內(nèi)酰脲支架在虛擬篩選下得到了強烈富集?；衔?也是高級別分子之一，由一個苯基哌嗪支架連接一個吲達唑-4-羰基組成，預(yù)計分別延伸到S2和S1口袋。

片段引導(dǎo)虛擬篩選MPro抑制劑

第二個虛擬篩分是基于在Diamond Light source進行的結(jié)晶碎片篩分。在晶體結(jié)構(gòu)(PDB:SRF7)中，化合物4占據(jù)S1和S2口袋，但與較大的抑制劑X77相比，化合物4沒有延伸到S1'或S3。片段到先導(dǎo)物的優(yōu)化是通過在> 100億個按需合成化合物的文庫中進行搜索，并結(jié)合對接篩選來選擇最佳候選化合物?；趯?fù)合物的可視化分析，文中設(shè)計了可以包含片段極性相互作用的關(guān)鍵特征的化學(xué)模式，并有可能將生長載體放入S1’和S2口袋。一個五元芳雜環(huán)和一個酰胺分別與His163和Glu166形成氫鍵，被認為是支架的關(guān)鍵，但S1口袋中雜環(huán)的大小和拓撲結(jié)構(gòu)是允許變化的。此外，還尋找了分枝酰胺和栓系酰胺，它們都有可能生長到S2口袋中。在商用小分子庫中，有超過200萬個與這些模式匹配的詳細說明，隨后被疊合到活性位點點上。

基于片段虛擬篩選得到的化合物5和8的配合物晶體結(jié)構(gòu)均被成功測定。晶體結(jié)合模式證實了對接預(yù)測，RMSD分別為1.3和1.4 A(圖3c,d)。

結(jié)構(gòu)導(dǎo)向抑制劑優(yōu)化

對從虛擬篩選中識別出的三種支架進行了Hit-to-lead優(yōu)化?；衔?和3所代表的支架的Hit優(yōu)化是由這些抑制劑與Mpro結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)(圖3a)。由于它們共同的乙內(nèi)酰脲支架與活性位點表現(xiàn)出良好的氫鍵互補性，這種化學(xué)型得以維持。在S1口袋中，基于化合物1的吡啶基部分的效力增加最大。根據(jù)結(jié)構(gòu)信息，排除了芳香氮附近位置的取代，因為這些位置很可能與蛋白質(zhì)表面發(fā)生沖突。相反，研究的重點是在晶體結(jié)構(gòu)中向Asn142延伸的生長載體，這也得到了化合物5占據(jù)S1的體積較大的苯并三唑支架以及通過晶體學(xué)篩選識別的合并片段的支持。異喹啉部分，也被確定為吡啶的有希望的延伸，導(dǎo)致了該系列中最高的效力。在S2口袋中，從化合物3的螺環(huán)類似物中鑒定出最佳取代基。與S1口袋中的吡啶相結(jié)合，化合物3的螺旋部分并沒有提高藥效，但該抑制劑的預(yù)測結(jié)合模式得到了結(jié)晶學(xué)的驗證。隨后進行了幾次嘗試，加入一個系結(jié)基序，將化合物1的烷基取代基剛性化，并增加與S2口袋的互補性。S1和S2口袋中的最佳取代基通過內(nèi)部合成被整合成一個單一的化學(xué)系列，從而協(xié)同提高了抑制劑的藥效和親和力。

本文選自JACS:Ultralarge Virtual Screening Identifies SARS-CoV-2 Main Protease Inhibitors with Broad-Spectrum Activity against Coronaviruses.