寫在前面

????????今天推薦的是由美國賓夕法尼亞州費(fèi)城托馬斯-杰斐遜大學(xué)西德尼-金梅爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)和分子生物學(xué)系在2021年1月4日發(fā)表于Journal of Clinical Investigation （IF：12.466，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Diane E Merry教授，研究表明泛素酶USP7有助于脊柱和球狀肌萎縮癥的致病性。

研究背景

????????多谷胺（polyglutamine，polyQ）疾病是一種破壞性的、緩慢進(jìn)展的神經(jīng)退行性疾病，由不同的、不相關(guān)的基因的編碼區(qū)中的polyQ編碼CAG重復(fù)序列的擴(kuò)展引起。在脊髓和橫紋肌萎縮癥（SBMA）中，雄性激素受體（AR）內(nèi)的polyQ擴(kuò)增導(dǎo)致進(jìn)行性神經(jīng)肌肉毒性，其分子基礎(chǔ)尚不清楚。

摘要部分

????????利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)，作者確定了由polyQ擴(kuò)展引起的AR相互作用組的變化。作者發(fā)現(xiàn)，去泛素酶USP7優(yōu)先與polyQ擴(kuò)展的AR相互作用，并且降低USP7的水平可以減少SBMA細(xì)胞模型中突變體AR的聚集和細(xì)胞毒性。此外，USP7敲除抑制了SBMA和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型（SCA3）果蠅模型的疾病表型，USP7的單等位基因敲除改善了轉(zhuǎn)基因SBMA小鼠的幾種運(yùn)動缺陷。USP7的過表達(dá)導(dǎo)致AR泛素化減少，表明USP7對AR有直接作用。利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)，作者確定了突變體AR上受USP7調(diào)控的泛素化賴氨酸殘基。最后，作者發(fā)現(xiàn)，在亨廷頓病的基因敲入小鼠模型的紋狀體和額葉皮層中，USP7也與突變的亨廷頓蛋白（HTT）發(fā)生不同程度的相互作用。總之，作者的發(fā)現(xiàn)揭示了USP7在SBMA的病理生理學(xué)中的關(guān)鍵作用，并表明在SCA3和亨廷頓病中也有類似的作用。

研究內(nèi)容

1.野生型和polyQ擴(kuò)增型AR的不偏推定量相互作用篩選? ? ? ?

????????可溶性AR擴(kuò)展的polyQ區(qū)可能會改變蛋白質(zhì)的整體構(gòu)象。因此，作者推測這種結(jié)構(gòu)改變的AR可能會與蛋白質(zhì)伙伴發(fā)生異常的相互作用，并且識別不同的polyQ擴(kuò)展的AR相互作用組可以提供對SBMA中工作的致病機(jī)制的見解。

????????因此，為了確定AR相互作用組的特征和該網(wǎng)絡(luò)的polyQ擴(kuò)展依賴性改變，作者采用了基于SILAC（細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記）的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以確定PC12細(xì)胞中共同IP的結(jié)合蛋白。以誘導(dǎo)表達(dá)AR10Q或AR112Q表達(dá)的PC12細(xì)胞為工具，通過多層IP實(shí)驗(yàn)篩選，USP7被確定為與polyQ-expanded AR用兩種抗體的優(yōu)先相互作用者。

研究結(jié)論：通過基于SILAC（細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記）的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析USP7被確定為與polyQ-expanded AR用兩種抗體的優(yōu)先相互作用者。

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2.USP7在體外和體內(nèi)優(yōu)先與polyQ擴(kuò)展的AR互動

????????作者對不同的AR相互作用組的分析確定了AR112Q和USP7之間強(qiáng)烈的相互作用。隨后作者通過AR表達(dá)的PC12細(xì)胞裂解物的共同免疫沉淀物進(jìn)行免疫印跡分析來驗(yàn)證這種優(yōu)先的相互作用；這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與AR10Q相比，USP7與AR112Q共同免疫沉淀的程度更高。

研究結(jié)論：AR-USP7復(fù)合物在細(xì)胞中的形成因AR蛋白中擴(kuò)展的polyQ段而增強(qiáng)。? ? ?

????????為了確定USP7是否在體內(nèi)與polyQ擴(kuò)展的AR相互作用，作者使用了SBMA轉(zhuǎn)基因小鼠模型，該模型在朊病毒蛋白（PrP）啟動子的控制下在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中表達(dá)人類全長的polyQ擴(kuò)展的AR（AR112Q）。作者從這個轉(zhuǎn)基因品系的雄性大腦和脊髓制備的組織裂解液中免疫沉淀了USP7，并通過免疫印跡檢測到多聚酶擴(kuò)展的AR的共沉淀表明這些蛋白質(zhì)在體內(nèi)相互作用。

????????為了進(jìn)一步研究USP7與內(nèi)源性突變體AR在體內(nèi)的相互作用，作者在SBMA的基因敲入（KI）小鼠模型的脊髓切片中進(jìn)行了PLA，在7個月大的雄性KI和WT運(yùn)動神經(jīng)元中觀察到PLA點(diǎn)，證實(shí)AR/USP7的相互作用發(fā)生在體內(nèi)運(yùn)動神經(jīng)元中的AR和USP7蛋白的內(nèi)源性水平。

研究結(jié)論：USP7在體內(nèi)與AR相互作用。

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3.USP7與polyQ-expanded AR的可溶性形式相互作用

????????以前的研究表明，AR112Q可以通過SDS-瓊脂糖凝膠電泳被解析為由全長蛋白組成的可溶性、3B5H10反應(yīng)性、緩慢遷移的集合體物種，以及由全長AR和N端AR片段組成的不溶性、快速遷移的物種。通過SDS-PAGE或SDS-瓊脂糖對相同的USP7免疫沉淀物進(jìn)行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)USP7相關(guān)的AR112Q在SDS-PAGE上以單體形式遷移，在SDS-瓊脂糖上以可溶性、緩慢遷移的形式遷移。此外，免疫熒光分析顯示，USP7不與聚集的AR112Q的核內(nèi)含物同位。

研究結(jié)論：USP7優(yōu)先與可溶性多Q擴(kuò)展的AR相互作用，而不與核內(nèi)含物共同定位。

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4.敲除USP7可以回補(bǔ)polyQ擴(kuò)展的AR的毒性和聚集

????????為了評估USP7和polyQexpanded AR之間的優(yōu)先互動是否在細(xì)胞功能障礙中起作用，作者確定了USP7敲除對AR112Q聚集和細(xì)胞毒性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，降低USP7的水平導(dǎo)致懷有核包涵體的細(xì)胞數(shù)量急劇下降（5-8倍），而不改變AR單體的穩(wěn)態(tài)水平。此外，SDS-瓊脂糖凝膠分析顯示，相對于對照組，USP7的部分敲除減少了快速遷移物種的數(shù)量。這一結(jié)果的原因仍在調(diào)查中；然而，值得注意的是，在正常人類成纖維細(xì)胞中也有類似的觀察，其中通過RNAi部分減少USP7的水平導(dǎo)致p53蛋白的不穩(wěn)定，但接近完全喪失USP7卻能穩(wěn)定p53。作者推測，這種現(xiàn)象可能與USP7的反饋調(diào)節(jié)及其在分裂細(xì)胞中的蛋白穩(wěn)定作用有關(guān)。

研究結(jié)論：在SBMA的一個細(xì)胞模型中，敲除USP7會減少polyQ擴(kuò)展的AR聚集并增加AR的周轉(zhuǎn)。

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5.USP7的單倍體功能可以回補(bǔ)DHT誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性

????????降低USP7的水平可以回補(bǔ)DHT誘導(dǎo)的polyQ擴(kuò)展的AR表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。這些結(jié)果表明，在polyQ擴(kuò)展的AR表達(dá)細(xì)胞中，部分降低USP7的水平可以回補(bǔ)polyQ依賴的表型。作者還評估了USP7單倍體的充足性對這種體外表型的影響。來自AR112Q小鼠E13.5胚胎的初級運(yùn)動神經(jīng)元在用DHT處理時發(fā)生細(xì)胞死亡，而來自AR112Q表達(dá)的USP7單倍體不足的轉(zhuǎn)基因小鼠（AR112Q/USP7+/-）的神經(jīng)元則對這種效應(yīng)不敏感。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了USP7在SBMA運(yùn)動神經(jīng)元毒性中的重要作用。

研究結(jié)論：USP7在SBMA運(yùn)動神經(jīng)元毒性中具有重要作用。

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6.USP7敲除可回補(bǔ)果蠅模型中的SBMA表型

????????由于降低USP7的水平對SBMA的細(xì)胞模型有保護(hù)作用，作者接下來試圖評估USP7在SBMA體內(nèi)病理生理學(xué)中的作用。因此，作者使用了SBMA的果蠅模型，表達(dá)AR52Q的果蠅顯示出一種眼睛表型，其特點(diǎn)是在含有DHT的飲食中長大，并在10天后成為成年人時，光感受器陣列從底層層膜上脫落。在DHT處理的第1天，對果蠅的分析沒有發(fā)現(xiàn)明顯的眼睛病變的跡象，確定在DHT處理的第10天觀察到的效果不是發(fā)育缺陷的結(jié)果，而是DHT誘導(dǎo)的AR52Q病變的結(jié)果。為了確定USP7在這一表型中的作用，作者用兩個不同的RNAi系敲除USP7。兩個RNAi系都導(dǎo)致了AR52Q依賴性和DHT誘導(dǎo)的眼睛表型的回補(bǔ)，達(dá)到了與不表達(dá)AR52Q的果蠅相當(dāng)?shù)乃健＿@些數(shù)據(jù)確立了USP7在體內(nèi)SBMA模型中介導(dǎo)多Q擴(kuò)展的AR病理學(xué)的功能作用。

研究結(jié)論：敲除USP7可以回補(bǔ)SBMA果蠅模型中DHT引起的毒性。

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7.USP7敲除可回補(bǔ)果蠅模型中的SCA3表型

????????為了確定USP7是否在其他polyQ疾病的致病性中起作用，作者評估了USP7在脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型（SCA3）的果蠅模型中的作用。在這個模型中，攜帶77個谷氨酸的全長Ataxin-3與飛眼中的膜靶向GFP一起表達(dá)。作者使用了基于CD8-GFP的技術(shù)，它能使眼睛內(nèi)部的變性可視化，而不需要進(jìn)行組織學(xué)檢測。隨著光感受器的死亡，GFP信號減弱，導(dǎo)致整體熒光的減少以及馬賽克的增加。作者選擇用這種技術(shù)來研究USP7和其他DUBs及相關(guān)蛋白對致病性Ataxin-3 77Q引起的毒性的作用。Ataxin-3 77Q的表達(dá)導(dǎo)致了GFP表達(dá)的損失，表明了眼睛的退化。在對致病性Ataxin-3的毒性抑制劑的定向檢測中，作者發(fā)現(xiàn)用于AR52Q的相同RNAi系敲除USP7導(dǎo)致變性表型的回補(bǔ)。因此，這些數(shù)據(jù)表明，SCA3的果蠅模型的表型回補(bǔ)并不是由于去泛素化功能的普遍喪失，而是由于USP7減少的一個特定后果。

研究結(jié)論：USP7可能在polyQ疾病的病理生理學(xué)中發(fā)揮廣泛的作用。

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8.USP7在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中改變了SBMA疾病的表型

????????在SBMA的細(xì)胞和果蠅模型中觀察到的降低USP7的細(xì)胞保護(hù)作用表明，在SBMA的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，降低USP7水平可能會改善疾病表型和或減緩疾病進(jìn)展。將USP7單倍體不足的SBMA轉(zhuǎn)基因小鼠（AR112Q/USP7+/-）與USP7野生型（AR112Q）的相應(yīng)SBMA小鼠以及兩個對照組進(jìn)行比較。(i) 非轉(zhuǎn)基因（ntg，SBMA），但USP7單倍體不足（ntg/USP7+/-）；(ii) USP7和SBMA均為野生型（ntg）。AR112Q雄鼠越過12毫米橫梁的速度明顯慢于ntg和ntg/USP7+/-雄鼠。值得注意的是，在AR112Q小鼠中失去Usp7的一個等位基因（AR112Q/USP7+/-）后，該任務(wù)的表現(xiàn)明顯改善。與AR112Q小鼠相比，AR112Q/USP7+/-在30周齡時顯示出減少的緊握表型，這表明USP7的部分損失導(dǎo)致這一行為的明顯改善。綜合來看，作者的數(shù)據(jù)清楚地表明，降低USP7對SBMA轉(zhuǎn)基因小鼠的行為表型有好處。

研究結(jié)論：在SBMA的小鼠模型中，USP7的單倍體功能可以回補(bǔ)一些運(yùn)動障礙，并恢復(fù)脊髓運(yùn)動神經(jīng)元中未磷酸化的NF-H水平。

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9.USP7促進(jìn)AR的聚集

????????USP7是一種泛在表達(dá)的蛋白質(zhì)，具有泛素特異性蛋白酶的活性，并被認(rèn)為與幾種蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)水平的調(diào)節(jié)有關(guān)，包括Mdm2和p53。作者評估了USP7的一種催化非活性形式對PC12細(xì)胞中poly擴(kuò)展的AR聚集的影響。為此，作者產(chǎn)生了表達(dá)AR112Q的PC12細(xì)胞系，該細(xì)胞系構(gòu)成性地過度表達(dá)FLAG標(biāo)記的野生型USP7或該蛋白的催化無活性（C223S）形式。作者觀察到，USP7的過量表達(dá)導(dǎo)致攜帶AR包涵體的細(xì)胞比例大幅增加，USP7 C223S的表達(dá)導(dǎo)致AR112Q誘導(dǎo)的包裹體水平明顯降低（相對于野生型USP7）。這些發(fā)現(xiàn)表明，USP7的去泛素酶活性與poly擴(kuò)展的AR聚集有關(guān)。

研究結(jié)論：USP7的去泛素酶活性與polyQ擴(kuò)展的AR聚集有關(guān)。

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10.AR是USP7去泛素酶功能的底物

????????為了確定USP7敲除是否會改變細(xì)胞中polyQ擴(kuò)展的AR的泛素化狀態(tài)，作者使用抗Ub和抗AR抗體進(jìn)行了接近PLA試驗(yàn)。表達(dá)AR112Q的PC12細(xì)胞顯示出PLA點(diǎn)，表明這些細(xì)胞中AR泛素化的穩(wěn)態(tài)水平。通過穩(wěn)定表達(dá)miR USP7 #1敲除USP7后，作者觀察到每個細(xì)胞中擁有更多點(diǎn)狀物的細(xì)胞比例有統(tǒng)計學(xué)意義的增加。這一發(fā)現(xiàn)表明，USP7的去泛素酶功能可以調(diào)節(jié)AR的泛素化狀態(tài)。

????????為了研究USP7去泛素酶功能對AR泛素化狀態(tài)的生化影響，作者還通過瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，用表達(dá)（i）AR111Q（有N端核定位信號）、（ii）HA標(biāo)記的Ub和（iii）FLAG標(biāo)記的USP7或GFP對照的質(zhì)粒來評估USP7依賴的AR泛素化。在這些細(xì)胞中過量表達(dá)USP7后，這種效應(yīng)被削弱，這表明USP7直接對AR進(jìn)行去泛素化。

????????為了確定AR112Q上被USP7泛素化的賴氨酸殘基，作者表征了USP7被敲除的細(xì)胞的全細(xì)胞泛素組。實(shí)驗(yàn)顯示，在兩個泛素組實(shí)驗(yàn)中，AR112Q上的8個賴氨酸殘基在敲除USP7后顯示出大于1.5倍的泛素化變化。

????????為了確定防止由USP7調(diào)節(jié)的賴氨酸殘基上的AR泛素化是否會影響其穩(wěn)定性和聚集，作者將8個確定的賴氨酸之一突變?yōu)榫彼帷Ｗ髡邉?chuàng)建了表達(dá)AR107Q K17R和AR108Q K17R的克隆PC12細(xì)胞，并評估了K17R突變對poly-Q擴(kuò)展AR聚集的作用。表達(dá)polyQ擴(kuò)增的AR-K17R的細(xì)胞表現(xiàn)出更高頻率的帶有聚集AR的細(xì)胞。此外，這些細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的DHT依賴性的AR穩(wěn)定，表明AR在賴氨酸17的泛素化在其降解中的重要作用。

研究結(jié)論：賴氨酸17是USP7的底物，支持USP7在賴氨酸17處對polyQ擴(kuò)展的AR進(jìn)行去泛素化的重要性。

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結(jié)論與討論

????????作者設(shè)想由于polyQ擴(kuò)展引起的AR相互作用網(wǎng)絡(luò)變化將揭示對SBMA的病理生理學(xué)以及潛在治療靶點(diǎn)的理解。在這篇文章中，作者確定了幾種與野生型和polyQ擴(kuò)增AR有差異的蛋白質(zhì)。其中的一種具有差異的蛋白是USP7，它與polyQ擴(kuò)增的AR優(yōu)先發(fā)生相互作用。實(shí)驗(yàn)還表明USP7在SBMA細(xì)胞模型中介導(dǎo)DHT依賴性突變AR聚集和細(xì)胞毒性。不僅如此，在SBMA小鼠模型以及SBMA和脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3型(SCA3)的果蠅模型中，降低USP7會減弱這些影響并改善疾病表型，這表明這種去泛素化酶與polyQ疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

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Thank you!

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原文鏈接:https://www.jci.org/articles/view/134565

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