在養(yǎng)細胞的過程中，總會有一些不速來客不請自來，比如真菌、霉菌等等。但最令人頭疼的還是支原體，它總是悄悄的來，對細胞造成極大的危害，今天就來認識一下支原體吧

支原體是目前為止發(fā)現(xiàn)的最小的原核生物，具有以下特點：

1.形態(tài)結(jié)構(gòu)與細菌相似，但又比細菌小，是介于細菌與病毒之間的微生物；

2.結(jié)構(gòu)簡單，只有細胞膜、細胞質(zhì)、核糖體、DNA、可溶性RNA和一些其它細胞內(nèi)含物，支原體的細胞器只有核糖體；

3.沒有細胞壁，具有多種形態(tài)，絲狀、球狀、扁平狀等；

4.體積小，最小的只有0.1μm，部分支原體甚至可以通過0.22μm濾器，但過濾器并不能完全去除支原體。

支原體的來源？

污染細胞的支原體種類有在二十種以上，其中95%以上的支原體污染是口腔支原體、精氨酸支原體、發(fā)酵支原體、萊氏無膽甾原體和豬鼻支原體五種。

支原體污染的來源

a.環(huán)境污染：

細胞培養(yǎng)房、細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺內(nèi)已被支原體污染；

b.實驗器材的污染：

移液槍、移液管、細胞培養(yǎng)皿、水浴鍋等已被支原體污染；

c.細胞培養(yǎng)試劑的污染：

培養(yǎng)基、胰酶、血清、細胞凍存液等已被支原體污染；

d.被污染的原代細胞；

e.操作人員在操作過程中帶來的污染等等

支原體的檢測方法

1.分離培養(yǎng)法：

檢測方法：將待檢樣品接種到適合支原體生長的液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中，如有支原體污染，液體培養(yǎng)基顏色會改變，固體培養(yǎng)基將會有菌落瘋狂生長。

優(yōu)點：該方法被稱為支原體培養(yǎng)法的金標準，可以檢測絕大多數(shù)支原體。

缺點：支原體生長到一定數(shù)量才能判斷是否有污染，檢測時間長，無法實現(xiàn)對支原體的快速檢測

2.原位染色法：

檢測方法：通過染色試劑（如DAPI、Hoechst 等）對待測細胞培養(yǎng)物進行染色，在熒光顯微鏡下觀察待測樣品的熒光判斷支原體污染。

優(yōu)點：可清晰直觀的看到支原體微粒。

缺點：死亡細胞釋放的DNA也會被染色，在支原體輕度污染時，較難判斷是否有支原體污染。

3.化學發(fā)光法

檢測方法：利用支原體特有酶的活性并通過ATP依賴的螢光素酶催化的發(fā)光反應進行檢測，通過比較檢測試劑加入前后ATP量的變化來確定樣品是否有支原體污染。

優(yōu)點：檢測快速，僅需15min即可完成檢測。

缺點：該方法只能檢測活的支原體，如果支原體死亡，將無法通過ATP的變化判斷支原體污染。

4.巢式PCR法：

檢測方法：通過設計兩對引物擴增支原體的DNA，第一對引物用于第一步PCR，用于初步判斷是否有支原體污染；用第二對引物進行第二輪PCR，觀察DNA條帶用于鑒定是否有支原體污染。

優(yōu)點:?通過兩輪PCR可以大大提高檢測的特異性和靈敏度，可根據(jù)擴增片段的大小大致預測支原體的種屬。

缺點：操作繁瑣，需要進行兩輪PCR。

5.探針法qPCR：

檢測方法：設計特異性引物和熒光探針，通過探針法qPCR高靈敏檢測培養(yǎng)的細胞等生物材料中是否有支原體污染。

優(yōu)點：靈敏度高，檢測快速，可一次性檢測大量樣品，PCR擴增后無需電泳分析即可判斷是否具有支原體污染。

缺點：該方法靈敏度很高，因此對實驗環(huán)境要求較為苛刻，且需要精密的qPCR儀器。

6.等溫擴增變色法：

檢測方法：通過設計4-6對特異性引物，在一定的恒定溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物進行核酸的快速擴增，并且通過顏色變化而無需電泳分析即可確定是否有支原體污染。

優(yōu)點：不需要反復的升溫和降溫，不需要精密的儀器，在恒定的溫度下即可對核酸進行擴增。反應結(jié)束后，無需電泳分析，通過顏色變化即可判斷是否具有支原體污染。

缺點：對引物要求較高，需要設計多對引物，且擴增產(chǎn)物不能用于測序。

如何預防支原體？

支原體危害這么大，難道我們就沒有辦法去進行有效應對嗎？其實我們可以從以下幾個方面預防支原體：

1.定期消毒：定期對細胞房、實驗服、移液槍、細胞培養(yǎng)箱等進行消毒，及時清除支原體；

2.檢查細胞培養(yǎng)試劑：選擇來源可靠的試劑及耗材產(chǎn)品，在進行細胞培養(yǎng)操作之前，檢查細胞培養(yǎng)基、血清、胰酶等試劑，可選擇合適孔徑的濾膜進行過濾除菌，使用過程中如發(fā)現(xiàn)有污染及時進行更換；

3.規(guī)范細胞培養(yǎng)操作：建立良好的細胞培養(yǎng)操作SOP，遵循無菌操作原則，規(guī)范穿戴實驗服、口罩、手套等，并在細胞培養(yǎng)開始時進行消毒；規(guī)范處理實驗廢棄物；

4.在培養(yǎng)基中加入支原體預防試劑

加入抑制支原體DNA合成的抗生素：如氟喹諾酮類抗生素；

加入抑制支原體蛋白質(zhì)合成的抗生素：例如大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素、雙萜烯類等抗生素；

加入非抗生素類支原體清除試劑：如膜活性多肽，通過與支原體膜特異性結(jié)合徹底清除支原體。

細胞被污染了怎么辦？

有讀者說，那如果我的細胞已經(jīng)被支原體污染了，那怎么辦啊？不要急，也不要馬上棄掉，我們可以及時清除支原體，對細胞進行挽救，減少支原體對細胞的危害。畢竟實驗室的細胞很珍貴?。?/p>

如果你的細胞已經(jīng)被支原體污染了，可以采取以下措施：

1.及時更換培養(yǎng)液：

減緩支原體的污染，但并不能完全清除；

2.使用抗生素類去除試劑：

抗生素對支原體有較好的抑制作用，可以有效清除支原體，但要注意的是，長時間使用抗生素，會產(chǎn)生耐藥性的風險。

在使用單一抗生素清除效果不佳時，可以考慮更換抗生素或者采用復合型抗生素試劑；

3.使用非抗生素去除試劑：

非抗生素清除試劑不會產(chǎn)生耐藥性，對支原體的清除效果可以達到100%，且?guī)缀鯇毎麤]有影響，是去除支原體的首選試劑。

4.實驗室環(huán)境清潔：

在發(fā)生支原體污染后，要及時處理已經(jīng)被污染的細胞，并對細胞房進行徹底的清潔消殺，防止交叉污染。

實驗過程中，我們的細胞很珍貴，實驗試劑也屬實不便宜呢，雖說我們現(xiàn)在已經(jīng)擁有了各種各樣的支原體清除和除菌劑產(chǎn)品，但是避免污染的最好方式還是注意實驗規(guī)范以及定期清潔，選擇來源可靠的試劑及耗材產(chǎn)品，不給細菌、真菌、支原體這些討厭鬼卷土重來的機會，最后甄鈺衷心希望大家的實驗都順順利利，遠離污染。

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