標(biāo)題：中國濃香白酒生產(chǎn)過程中人工窖泥中原核生物群落的結(jié)構(gòu)和功能變化

研究對象：?濃香白酒、人工窖泥

期刊：mSystems

影響因子：6.469

發(fā)表時間：2020年3月

合作單位：四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所

運用歐易/鹿明生物技術(shù)：TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)、PRM靶向驗證、非靶向GC-MS代謝組學(xué)、LC-MS代謝組學(xué)、16S?rRNA測序

研究背景

通過固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的中國烈酒濃香白酒是世界上最古老的餾出物之一，年產(chǎn)量為910萬噸。濃香白酒包含己酸乙酯，丁酸乙酯，乳酸乙酯和乙酸乙酯等多種風(fēng)味酯。根據(jù)己酸乙酯的含量，可以將濃香白酒質(zhì)量分為不同等級。增加己酸乙酯與乳酸乙酯的比例可以提高濃香白酒的質(zhì)量。濃香白酒發(fā)酵的主要谷物是高粱，其發(fā)酵涉及源自泥漿的多種微生物和一種稱為大曲的糖化發(fā)酵劑。

礦坑窖泥中的微生物會產(chǎn)生各種小分子有機酸（例如己酸，丁酸，乙酸和乳酸），它們是風(fēng)味酯的關(guān)鍵前提物，這在很大程度上決定了濃香白酒的質(zhì)量。由于在成熟窖泥中有特殊的微生物群落，因此只能使用成熟的窖泥來釀造高質(zhì)量的濃香白酒。但是泥漿的自然成熟期超過20年，這嚴重限制了高質(zhì)量濃香白酒的生產(chǎn)。自1960年代以來，基于對天然窖泥微生物學(xué)的了解，人們開始生產(chǎn)人工窖泥以提高高質(zhì)量濃香白酒的產(chǎn)量。

通常，人工窖泥的制備方法是將發(fā)酵劑接種到新鮮土壤、天然成熟的窖泥、小麥和豆粕的混合物中，然后在厭氧條件下孵育30至60天。當(dāng)前已有多種可培養(yǎng)和免培養(yǎng)方法研究過人工窖泥中的微生物群落，然而我們對人工窖泥中微生物動力學(xué)和相關(guān)功能變異的分子機制以及這種變異在高質(zhì)量濃香白酒生產(chǎn)中作用的了解仍然有限。

研究流程

結(jié)果展示

作者從濃香白酒釀造的初始狀態(tài)以及前四個釀造批次結(jié)束時對人工窖泥進行采樣，每批次的釀造時間為90天。對其理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，人工窖泥成熟過程中樣品的腐殖質(zhì)和有效磷含量分別增加41.84％和200.00％（P< 0.05）（表1）。隨著時間的推移，水分、有機物、pH、總氮、總磷、總鉀、NH4+和有效鉀含量保持相似。

表1 |濃香白酒釀造過程中人工窖泥樣品的理化和原核生物群落特性

在濃香白酒樣品中總共檢測到31種風(fēng)味化合物：12種酯，8種醇，6種酸，3種醛和2種酮。主要風(fēng)味化合物包括己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、1-丙醇、3-甲基丁醇、正己醇、2-丁醇、乙酸、丁酸、己酸、異戊酸和乙醛二乙縮醛。這13種風(fēng)味物質(zhì)占樣品中風(fēng)味物質(zhì)的95.73%（圖1a）。釀造過程中己酸乙酯和丁酸乙酯的含量增加（P <0.05），且分別在第四批和第三批濃香白酒樣品中達到最高水平。從第一批到第二批，乙酸乙酯含量顯著下降（P <0.05）（圖1b）。己酸乙酯/乳酸乙酯的比率從0.81穩(wěn)定增加到2.77（P <0.05），表明濃香白酒的質(zhì)量有所提高（圖1c）。

圖1 | 濃香白酒釀造過程中風(fēng)味化合物動力學(xué)

（a）濃香白酒樣品中風(fēng)味化合物濃度的熱圖，紅色為主要化合物。

（b）濃香白酒樣品中己酸乙酯，乙酸乙酯，乳酸乙酯和丁酸乙酯的濃度。

（c）己酸乙酯/乳酸乙酯的比率。B，第一批；C，第二批；D，第三批；E，第四批。

主成分分析（PCA）中，原核生物群落顯示出批次依賴性的聚類（圖2a）。OTU分為36個原核生物類別。在至少一個人工窖泥成熟階段，最豐富的9種類別分別是芽孢桿菌、梭狀芽胞桿菌、結(jié)腸桿菌、放線菌、Negativicutes、γ-變形細菌、Alpha變形細菌、Bacteroidia和Synergistia(圖2b)。使用qPCR對最豐富的OTU（梭狀芽胞桿菌和乳桿菌）進行了定量，梭狀芽孢桿菌的濃度在第一批次中顯著下降，隨后逐漸提升。而乳桿菌濃度在第一批次中顯示上升，隨后在第二批次中下降（圖2c）。

圖2 | 人工窖泥樣品中原核生物的16S rRNA基因分析

（a）OTU的主成分分析。

（b）最豐富的原核生物類別的比例。

（c）梭狀芽孢桿菌和乳桿菌的16S RNA基因拷貝的平均數(shù)量。

（d）預(yù)測的與糖和有機酸代謝有關(guān)的KEGG直系同源物的豐度。A，初始階段；B，第一批；C，第二批；D，第三批；E，第四批。

人工窖泥理化特性與最豐富的原核屬之間的Pearson相關(guān)分析表明，總氮，有效磷和有效鉀與15個屬相關(guān)（圖3a）。在15個屬中，有6個屬與濃香白酒樣品中的8種以上主要風(fēng)味化合物相關(guān)（圖3b）。

圖3 | 主要原核屬與理化特性之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)

（a）人工窖泥（b）濃香白酒樣品的風(fēng)味成分。

接下來，作者為了更深入地了解功能變化及其與濃香白酒質(zhì)量的關(guān)系，對第一批和第四批人工窖泥樣品進行了蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析。通過TMT蛋白質(zhì)組學(xué)方法共鑒定到213種原核蛋白，三個最豐富的類占原核蛋白的78.39%（圖4a）。Negativicutes（32.39%）是最豐富的類，其次是Clostridia（23.00%）和Bacilli（23.00%）。鑒定到的蛋白質(zhì)來自于70個屬，其中乳桿菌有18.31%，梭菌有9.86%，孢子蟲有5.16%（圖4b）。共鑒定到來自24個屬的47種差異蛋白，這些差異蛋白主要屬于乳酸桿菌（圖4c）。差異蛋白的GO分析發(fā)現(xiàn)最大的變化發(fā)生在代謝過程中，包括ADP代謝過程，嘌呤核糖核苷二磷酸代謝過程和嘌呤核苷二磷酸代謝過程（圖4d）。

圖4 | 第一批和第四批人工窖泥樣品中原核生物群落的宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析

（a）基于綱的原核生物分類。

（b）基于屬的原核生物分類。

（c）差異蛋白。

（d）差異蛋白的GO富集。

非靶向代謝組學(xué)分析共鑒定出7,478種代謝物。GC-MS代謝組學(xué)和LC-MS代謝組學(xué)方法在OPLS-DA中均可明確分離批次（圖5a至d）。在第四批人工窖泥樣品中，分別上調(diào)和下調(diào)了491和523種代謝物。差異代謝產(chǎn)物被分為16個功能類別（圖5f）。脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子（38.07%）最多，其次是有機雜環(huán)化合物（16.17%）和有機酸及其衍生物（13.11%）。

圖5?| ?第一批和第四批人工窖泥樣品的代謝組學(xué)分析

OPLS-DA散點圖（a和b）以及相應(yīng)交叉驗證圖（c和d）。其中（a和c）來自GC-MS，（b和d）來自LC-MS。差異代謝物的強度水平（e）和官能團（f）。（g）己酸，丁酸和乳酸的平均水平。

在濃香白酒決定風(fēng)味酯的關(guān)鍵物質(zhì)中，第四批人工窖泥樣品中的己酸含量高于第一批人工窖泥樣品（P <0.05），而丁酸和乳酸含量降低（P< 0.05）（圖5g）。基于KEGG富集分析，確定了產(chǎn)生己酸，丁酸和乳酸的代謝途徑（圖6）。在多種途徑中，丁酸代謝和丙酮酸代謝途徑直接參與己酸，丁酸和乳酸的產(chǎn)生。

圖6 | 人工窖泥樣品中己酸，丁酸和乳酸合成有關(guān)的途徑，蛋白質(zhì)，代謝物和物種的示意圖

實驗結(jié)論

這項多層組學(xué)研究鑒定了在人工窖泥成熟過程中顯著改變的分類群特異性功能和代謝途徑。結(jié)果揭示了原核生物群落中的幾個成員與人工窖泥中的代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)之間的關(guān)鍵聯(lián)系。這些候選微生物、蛋白質(zhì)和代謝物可能成為預(yù)測人工窖泥質(zhì)量及其發(fā)酵狀態(tài)的靶標(biāo)，這將有助于進一步優(yōu)化人工窖泥的培養(yǎng)技術(shù)并提高濃香白酒的質(zhì)量。

小鹿推薦

濃香白酒占中國白酒總產(chǎn)量的70%以上。自1960年代以來，在中國白酒釀造行業(yè)中，人工窖泥被廣泛用于建造發(fā)酵窖以生產(chǎn)高質(zhì)量的濃香白酒。為了深入了解人工窖泥原核生物分類和功能動力學(xué)機制，以及這種變化與生產(chǎn)高質(zhì)量濃香白酒之間的聯(lián)系，本文對該釀造微生態(tài)系統(tǒng)進行了首次進行了16S?rRNA測序，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析。多組學(xué)方法能夠更全面地了解高質(zhì)量濃香白酒生產(chǎn)過程中人工窖泥微生物群落發(fā)生的代謝過程變化，這將有助于進一步優(yōu)化人工窖泥培養(yǎng)技術(shù)和改善濃香白酒的質(zhì)量。

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