前言

母乳微生物是新生兒腸道共生細(xì)菌的重要來源，可通過喂養(yǎng)方式從母體傳播給新生兒，有助于新生兒初始腸道微生物群的建立，調(diào)節(jié)新生兒在短期和長期的健康狀態(tài)。母豬母乳是仔豬出生后三周的主要食物來源，而早期斷奶常導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，限制了商業(yè)豬斷奶后的發(fā)育。以往研究主要通過非培養(yǎng)方法了解母豬乳微生物群組成和群落多樣性，未曾使用培養(yǎng)依賴方法系統(tǒng)地研究可能間接或直接有利于早期斷奶仔豬精確護理的母豬乳微生物群。

6 月 1 日，湖南師范大學(xué)生命科學(xué)院尹佳教授和中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所的印遇龍院士為通訊作者，在 Microbiome 期刊（IF=14.652）發(fā)表了題為“Antioxidant potential of Pediococcus pentosaceus strains from the sow milk bacterial collection in weaned piglets”的研究論文，報道了母乳菌群的戊糖片球菌SMM914可激活仔豬肝臟中抗氧化信號通路Nrf2-Keap1，為闡明母豬乳細(xì)菌對促進仔豬健康發(fā)育提供新的見解。

研究內(nèi)容解析

建立母豬乳細(xì)菌收集法(smBC)

采用母豬乳收集法、厭氧培養(yǎng)法和測序法等手段對母豬乳微生物群(SMM)進行了大規(guī)模培養(yǎng)和鑒定，共獲得了1240株分離株，通過在CD-HIT分析，將這些分離株劃分為271個細(xì)菌類群，利用 silva 16SrRNA 數(shù)據(jù)庫、NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫和DAIRYdb內(nèi)參基因數(shù)據(jù)庫將這些序列分為兩類：疑似新細(xì)菌物種和已鑒定的物種。

基于序列之間的距離，建立的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示有120個類群不能被分配到任何已鑒定的物種（圖1），內(nèi)圓圈描述了被分離出來的細(xì)菌的分類，其中綠色表示變形菌門，黃色表示厚壁菌門，紅色表示戊糖片球菌，每個分類節(jié)點上提供每個物種內(nèi)不同分類群的數(shù)量。外環(huán)上綠色或黃色的色階表示從乳制品中識別出的疑似新物種和已知物種的概率（%）。

圖1 | 母豬乳汁中的細(xì)菌收集與鑒定

篩選戊糖片球菌類的益生菌

對病原菌活性拮抗以控制其傳播，是豬潛在益生菌菌株的重要篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過抑菌實驗評估不同戊糖片球菌分離株對常見病原菌的抗菌活性，篩選到10株抗菌活性最強且菌株形態(tài)為圓形、成對或四聯(lián)體的候選益生菌（圖2a）。黑腹果蠅模型實驗通過百草枯處理評估果蠅存活率進一步篩選具有強抗氧化活性的益生菌（圖2b-c），結(jié)果顯示在百草枯處理45小時后，有戊糖片球菌SMM914定植的果蠅在百草枯刺激下的存活率顯著提高，表明戊糖片球菌SMM914在果蠅中具有抑菌活性，增強了果蠅對百草枯誘導(dǎo)脅迫的抗性。進一步對SMM914的基因組進行測序，共產(chǎn)生28個序列，總大小為1,924,818bp，GC含量為37.14%。通過對SMM914的注釋，存在抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因，包括有機酸、硫氧還蛋白和胞外多糖等。

圖2?| 戊糖類益生菌候選菌株的篩選

戊糖片球菌SMM914對仔豬抗氧化能力的影響

仔豬出生后，分別在第10、12、14、16和18天口服低劑量（LD）或高劑量（HD）戊糖片球菌SMM914(圖3a)，肝臟疾病生物標(biāo)志物丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和乳酸脫氫酶(LDH)均降低（圖3b）。肝臟中Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Keap1蛋白水平受到顯著抑制(p<0.05)，但也導(dǎo)致醌氧化還原酶(NQO-1)、過氧化氫酶(CAT)、血紅素氧合酶1(HO-1)和超氧化物歧化酶(SOD)的蛋白水平升高，且呈濃度依賴性（圖3c-e）。

在酶活性測定中，HD組同時增加了肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、CAT活性和SOD活性(p<0.05)(圖3g)。此外，與對照組相比，HD組顯示肝臟中脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物丙二醛(MDA)濃度顯著降低(圖3g)。這些數(shù)據(jù)表明，戊糖片球菌SMM914可通過激活Nrf2-Keap1抗氧化信號通路提高仔豬抗氧化能力，并減輕斷奶期間的肝損傷。

圖3 | 戊糖片球菌SMM914對仔豬抗氧化能力和細(xì)胞保護性Nrf2通路激活的影響

戊糖片球菌SMM914對仔豬抗氧化能力的影響

為了更好地了解戊糖片球菌SMM914的抗氧化作用，進一步檢測了三組樣本血漿的代謝譜(n=7)。PLS-DA圖顯示出最優(yōu)擬合優(yōu)度(R=0.996，Q=0.681(圖5a)；R=0.994，Q=0.479(圖4b)，表明該模型具有良好的預(yù)測性和可靠性。

代謝組學(xué)結(jié)果表明，戊糖片球菌SMM914處理后主要影響的代謝物和代謝途徑包括谷胱甘肽代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，類固醇激素生物合成和初級膽汁酸生物合成（圖4d-h）。此外，KEGG通路富集表明戊糖片球菌SMM914對斷奶仔豬的保護作用可能通過圖5c所示整合的代謝途徑進行。

圖4 | 血漿的代謝圖譜

?SMM914對仔豬結(jié)腸微生物群的影響

斷奶仔豬從母乳到固體飼料的轉(zhuǎn)變，腸道微生物群組成的紊亂可通過肝-腸軸誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，采用16S rRNA基因擴增子測序技術(shù)對仔豬結(jié)腸微生物群進行了進一步研究，三組共有的細(xì)菌群落有89個屬，LD組和HD組特有11個和20個屬；NMDS圖直觀顯示高劑量HD組和對照組樣本在距離上能明顯區(qū)分開(stress=0.054，R=0.8630，p=0.001，ANOSIM)，但低劑量LD組的樣本沒有在ASV水平上與對照組很好地分離(圖5b-c)；群落結(jié)構(gòu)則顯示HD組在科和屬水平上均表現(xiàn)出明顯的群落變化，高劑量口服戊糖片球菌SMM914使仔豬結(jié)腸微生物菌群富含乳酸菌（乳酸菌消耗與氧化損傷有關(guān)）、克里斯滕森菌科R-7（正調(diào)控腸道免疫反應(yīng)）和瘤胃球菌科UCG-005屬（與肝功能衰竭呈負(fù)相關(guān)），而對照組結(jié)腸微生物群中擬桿菌科和普雷沃菌科屬（已報道與各種疾病相關(guān)）相對豐度較高，這些結(jié)果表明戊糖片球菌SMM914在仔豬早期斷奶應(yīng)激過渡過程中正向調(diào)控腸道菌群。

圖5 | 結(jié)腸內(nèi)的微生物多樣性組成分析

研究結(jié)論

本研究利用培養(yǎng)組學(xué)從母豬乳中分離乳酸菌，建立了一套快速篩選潛在有益菌株的方法。就產(chǎn)自母豬乳汁的新型戊糖片球菌的益生菌特性而言，在豬飼養(yǎng)試驗中，給予戊糖片球菌SMM914可通過降低血漿中白蛋白ALT和總蛋白TP水平從而降低仔豬在斷奶期間潛在的肝損傷。此外，口服戊糖片球菌SMM914可提高仔豬心臟系數(shù)，激活肝臟Nrf2-Keap1通路，干擾血漿中氨基酸代謝物水平并增加結(jié)腸中的有益微生物群?？傊?，本研究闡明了母豬乳微生物群在母豬和后代之間的重要性，并擴展了對戊糖菌益生菌潛力的理解。

圖6 從母豬母乳中進行大規(guī)模細(xì)菌培養(yǎng)的流程

湖南師范大學(xué)王樂蒞為第一作者。歐易生物在本項目中承擔(dān)了代謝組學(xué)實驗和生信分析工作。

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