蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot，是一種常用實驗手段，本人對實驗前期經(jīng)驗進行總結(jié)，希望對各位科研人員有所幫助和借鑒。

01

相關(guān)試劑配置

電泳液：Tris 3.03g? ?

? ? ? ? ? ? ? ?甘氨酸? 18.8g

? ? ? ? ? ? ? ?SDS? 1g

轉(zhuǎn)膜液：Tris 3.03g

? ? ? ? ? ? ? ?甘氨酸? 14.4g

? ? ? ? ? ? ? ?ddH2O? 800ml

? ? ? ? ? ? ? ?甲醇? 200ml

TBST(10×)：Tris? 12.1g

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? NaCl? 40g

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?ddH2O 500ml

02

實驗步驟

01

配膠（以雅酶配膠盒為例）

推薦：

7.5%膠：分子量 30以上；

10%膠：分子量20~150；

12.5%膠：分子量50以下；

取玻璃板，長短各一。檢查玻璃板是否干凈，可用擦鏡紙對玻璃板進行清潔。將兩玻璃板貼在一起（注：字在上），插入夾內(nèi)，用大拇指輕推玻璃板，敲一敲桌面，使玻璃杯底部對齊夾緊玻璃板。將塑料墊放于架子上，放上制膠架上。

（注：第一次操作可用水檢測是否漏水，否即可將水倒出，用吸水紙吸干水，進行下一步操作。如出現(xiàn)泄露，需檢查，從新調(diào)整，保證不漏水的情況下方可進行下一步）

下層膠：

AB液：1：1配置（1.0玻璃板兩板：5ml：5ml）

促凝劑：100ul

壓膠液（異丙醇/無水乙醇）：1ml

時間：15分鐘以上

（倒出，用去離子水沖洗，濾紙吸干）

上層膠：

AB液：1：1配置（1.0玻璃板兩板：2ml：2ml）

促凝劑：40ul

灌入后，根據(jù)樣本數(shù)量不同選擇不同梳子類型

（推薦15口梳子，內(nèi)參更易齊哦?。。。?/p>

時間：30分鐘以上

02

電泳

將制好的膠板取出，安裝于電泳槽上（注：小玻璃板在內(nèi)側(cè)，如只制作一板膠，則需將假板放于一側(cè)，防止電泳液泄露）。將電泳槽放于電泳盒中，雙手分別捏住梳子輕輕拔出，檢查膠口是否被膠堵住，如果正常便向電泳槽加電泳液至溢出為止。

根據(jù)樣本數(shù)量，吸取3ul marker于膠板口（建議樣本兩側(cè)都加3ul，防止邊緣效應(yīng)），并依次加入適量上樣液（注：上樣時需緩慢注入，樣本第一次上樣推薦10ul，副口，方便后期調(diào)整內(nèi)參）。然后向電泳槽中加入適量電泳液。

電壓120V，所需時間需預實驗嘗試確定（如果配置本文電泳液，推薦60min），至marker分出所需位置marker后即可停止。

03

轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)為例）

根據(jù)實際情況剪取適合大小的PVDF膜（推薦4cm寬，長：15口一口0.5cm，10口一口1cm）。

（注：需剪去一角確定方向）

取適合大小的水槽，倒入適當?shù)霓D(zhuǎn)膜液，將轉(zhuǎn)膜夾（黑板—海綿—厚濾紙，厚濾紙—海綿——透明板）浸入轉(zhuǎn)膜液中，隨后取出。

將玻璃板在梳子口這側(cè)撬開，切到適合大小。將厚濾紙（黑板側(cè)）蓋在膠上，翻轉(zhuǎn)。小心將膠轉(zhuǎn)到厚濾紙上，將厚濾紙放于海綿（黑板側(cè)）上，調(diào)整膠塊，使marker與厚濾紙底邊垂直。隨后在膠上確定加樣方向，后期將PVDF膜一角在加第一樣側(cè)，方便后期顯影確定加樣順序。

將PVDF膜浸入甲醇中1min左右，將PVDF膜放于膠上適合位置（用marker條帶確定）。剪掉一角邊在加第一樣側(cè)，蓋在膠上，用滾輪排出氣泡，蓋上另一側(cè)濾紙，海綿，透明板。將轉(zhuǎn)膜板放于轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)，黑板對黑邊。

倒入轉(zhuǎn)膜液，放入冰袋。電流200mA，時間需預實驗確定（推薦：75分子量以下120min，75分子量以上180min）。?

（推薦：后面每步之間均需要TBST清洗，5min，4次）

04

封閉

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將整塊PVDF膜放入孵育盒，TBST洗5min，倒入封閉液（根據(jù)封閉液不同，條帶背景不同，封閉不同時間）。

05

切膜

將洗好的膜放在塑料薄膜上，蓋上塑料薄膜，防止切割時損壞條帶。建議兩marker間選擇做一個目的蛋白，否在可能出現(xiàn)切掉的情況。如果第一次做建議寬一些，使兩marker在膜上即可。

（這步TBST洗一次即可）

06

一抗

加入適當?shù)囊豢瓜♂屢海?℃過夜/室溫2小時，可回收。

(如果蛋白表達高，建議4℃過夜，效果最好)

(如果蛋白表達量低，建議室溫兩小時)

07

二抗

加入適當?shù)亩瓜♂屢海覝?小時

隨后顯影即可?。?！

02

相關(guān)問題解答

01

背景深？

如果是第一次做，一抗二抗均是新的，內(nèi)參背景正常，那么就是一抗問題。

解決方法：①4℃封閉過夜

? ? ? ? ? ? ? ? ? ②換封閉液

? ? ? ? ? ? ? ? ? ③換一抗

如果是第一次背景正常，突然背景深了，建議一抗，二抗，封閉液同時配新的。

最快解決問題，不要浪費時間?。?！

02

條帶不出？

說明書建議分子量一般沒問題，那么要不就是表達量低，要不就是一抗不行，最不可能的就是二抗錯了，那就有點傻了?。?！

解決方法：①降低一抗稀釋比，

? ? ? ? ? ? ? ? ?如原1：1000改為1：200

? ? ? ? ? ? ? ? ? ②提供樣本蛋白濃度

? ? ? ? ? ? ? ? ? ③換一家試劑商的一抗

以上三種都不行，別掙扎了，就是沒有，何必呢?。。?/p>

03

內(nèi)參齊？

建議在一塊膠板上一個樣本做兩次。

解決方法：加樣順序如下，每口10ul

marker、A、B、C、marker、A、B、C、marker

顯影后，算各口灰度值，取各樣本所對最大值。

以灰度值最低的樣本定為最大上樣量10ul。

假設(shè)是C樣本灰度值是最低，那么A或B加樣量=10ul×C灰度值/A或B灰度值