其實從嚴格的詞學(xué)意義上來說，細胞程序性死亡（PCD）與細胞凋亡是有很大區(qū)別的。細胞程序性死亡，是個功能性概念，描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預(yù)定的，并受到嚴格程序控制的正常組成部分。而細胞凋亡則是一個形態(tài)學(xué)的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學(xué)特征的與壞死完全不同的細胞死亡形式。

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細胞凋亡形態(tài)變化：細胞膜、細胞器相對完整，細胞核固縮

從左至右依次是細胞核核縮、核溶、核碎

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接下來我們了解一下細胞凋亡的檢——測——方——法：

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按分類，細胞凋亡的檢測方法有形態(tài)學(xué)檢測、細胞功能檢測，以及生化標記檢測法。那么這些方法又有哪些優(yōu)缺點呢？

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1、形態(tài)學(xué)檢測方法：

1）細胞器亞顯微結(jié)構(gòu)觀察，電鏡：

優(yōu)點：凋亡檢測金標準。

缺點：無法定量；實驗步驟繁瑣。

2）細胞核染色、鏡檢（Hoechst 33342）

優(yōu)點：成本低、操作方便、可定量。

缺點：需對細胞進行計數(shù)。

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2、細胞功能檢測方法：

1）線粒體膜電位檢測 JC-1，MitoTracker

優(yōu)點：適合成像檢測，染色結(jié)果只能用來判斷線。

缺點：粒體膜電位是否丟失，不能定量。

2）細胞膜表面磷脂酰絲氨酸檢測 Annexin V-AbFluor? 488/PI

優(yōu)點：受歡迎的細胞凋亡檢測方法。

缺點：需制備單細胞懸液，可對凋亡不同時期比例進行定量。

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3、生化標記檢測法

1）凋亡分子標記檢測 Caspase的活性檢測 Caspase含量檢測（WB）

優(yōu)點：能夠進行高通量篩選、可定量。

2）DNA損傷檢測 DNA電泳 TUNEL法

優(yōu)點：適合用于組織切片樣本的凋亡研究。

缺點：電泳檢測耗時，無法定量，穩(wěn)定性差。

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精準細胞凋亡檢測的組合檢測方法

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一、Annexin V-AbFluor 488/PI檢測方法

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將Annexin V-AbFluor 488（綠色熒光）與PI（紅色熒光）配合使用，可以準確的區(qū)分開凋亡早期、凋亡晚期及死細胞。

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對于這種方法樣本處理、染色操作及熒光的拍照決定了凋亡檢測的精準度，對于不用樣本及不同的檢測方法，建議按照如下寶貴經(jīng)驗進行：

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1、熒光拍照關(guān)鍵

1）懸浮細胞或重懸液制片拍照

將細胞用少量PBS或重懸液將細胞重懸成細胞濃縮液，吸取5-10ul在潔凈的防脫載玻片上進行畫圈涂片，蓋上蓋玻片立刻在顯微鏡下立即進行鏡檢。處理過程中注意速度，防止細胞死掉，重懸密度不易過小，進行涂片時以小于10ul的細胞懸液體積zui適，整個操作建議在10min內(nèi)完成。

2）細胞培養(yǎng)小皿或爬片拍照

皿底留有少量緩沖液，避免干片。拍照前一定先輕柔清洗，防止因清洗不充分導(dǎo)致拍照過程中有非特異性背景。

用喜樹堿誘導(dǎo)Hela細胞24小時，用Annexin V-AbFluor 488凋亡檢測試劑盒（KTA0002）進行染色。能被Annexin V- AbFluor 488/PI染色(綠色膜和紅色碎片核)是早期凋亡細胞、壞死或晚期凋亡細胞。

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2、流式實驗關(guān)鍵步驟

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1）消化細胞時避免假陽性

為防止假陽性的產(chǎn)生，消化細胞建議使用無EDTA的胰酶。

2）設(shè)置對照組

在流式細胞術(shù)中所測得的量是相對值，而非值。如需知道值則必

設(shè)置對照組，對照組包括有陰性對照和陽性對照。上機檢測時建議設(shè)置空白組，Annexin V-AbFluor 488/PI單染組對照組，另需要提前調(diào)試好流式細胞儀。

3）檢測的細胞量要適中

建議準備足量細胞，一般建議1×106 個細胞，如細胞太少檢測時樣本流量相對會增大從而影響變異系數(shù)，結(jié)果不準確，如細胞量太多加入的抗體或染料相對不足，結(jié)果也受影響。

喜樹堿誘導(dǎo)Hela細胞24小時，用Annexin V- AbFluor 488凋亡檢測試劑盒（KTA0002，Abbkine）進行檢測。使用Annexin V-AbFluor 488和碘化丙啶PI可以區(qū)分早期凋亡細胞(Annexin V- AbFluor? 488陽性)、晚期凋亡或壞死細胞(Annexin V- AbFluor? 488和碘化丙啶陽性)。

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二、TUNEL檢測方法

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1、組織TUNEL實驗中關(guān)鍵步驟

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1）充分脫蠟和水化 <TIPS>

脫蠟前切片可以先在65℃烤箱中烘烤30min，再使用二甲苯進行脫蠟10-20min，而水化則用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗5min。

2）把握好細胞通透的時間 <TIPS>

根據(jù)切片的厚薄選擇蛋白酶k的孵育時間，蛋白酶K使用濃度不得低于

20 μg/mL，常用37℃處理10-30 min，6um切片時間稍短，20um切片增長時間，通過摸索達到既不脫片又能夠使后面的酶和抗體進入胞內(nèi)。處理時間過長易脫片、過短達不到通透效果。

3）適當(dāng)延長TUNEL反應(yīng)液時間 <TIPS>

建議處理條件是37℃反應(yīng)2 h，可以根據(jù)預(yù)估的凋亡損傷程度選擇更長的時間，建議結(jié)合zui終的背景著色進行判斷。

4）PBS的充分清洗 <TIPS>

在TUNEL反應(yīng)后的清洗應(yīng)十分嚴格，建議使用PBST重復(fù)清洗后再換PBS徹底清洗，或者增加PBS洗滌次數(shù)，因為這些清洗直接決定zui后切片的非特異性著色。

小鼠腸道組織石蠟切片，200倍放大，紅色熒光為發(fā)生晚期凋亡的細胞。

使用試劑：KTA2011 TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒 (橙色熒光)、DAPI

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操作步驟流程圖：

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2、細胞TUNEL實驗中關(guān)鍵步驟

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1）加藥模型的判斷處理 <TIPS>

細胞樣本做TUNEL時一定需要確認模型是否成功，在白光的鏡檢時需能明顯判斷凋亡的細胞。

2）蛋白酶k的使用<TIPS>

蛋白酶K目的是通透細胞膜和核膜，從而使反應(yīng)試劑充分進入細胞核進行反應(yīng)，提高陽性率。濃度過高或孵育時間太長非常容易使細胞脫落，建議使用20 μg/mL的蛋白酶K（0.5% Triton X-100），反應(yīng)時間建議為5-15 min。

注意：關(guān)鍵試劑蛋白酶K一定需要摸索出zui適合的使用條件。如溫度過高，反應(yīng)時間過長，易破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性。

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文章來源：http://www.abbkine.cn/apoptosis-annexin-v-pi-tunel