一本關(guān)于講述狼群重返黃石國(guó)家公園，以及其引入、研究與管理，討論狼群今日面臨的挑戰(zhàn)的專著。

編者：Douglas W. Smith, Daniel R. Stahler, Daniel R. MacNulty

下面是書正文第三部分：

上接：?

（基本為閱讀時(shí)順帶搞的 無太多修正的純機(jī)翻，機(jī)翻味比較濃，感興趣可以湊活看看）

黃石狼在遺傳學(xué)研究的最前沿

狼302M迅速穿過公路，來到浮島湖的冰面上。它短暫地停下腳步，回頭看了一眼北方，然后離開視線進(jìn)入樹林，幾乎沒有注意到那些停下來欣賞這一典型的黃石狼景象的車輛。那是2003年的繁殖季節(jié)，302M正在從它在黑尾鹿高原的出生地到拉馬爾谷進(jìn)行看似戰(zhàn)略性的巡視，那里有潛在的配偶在等待。就在幾天前，黃石狼項(xiàng)目在拉瑪爾山谷的山上捕獲了302M，并對(duì)其進(jìn)行了追蹤。在處理過程中，包括安裝無線電項(xiàng)圈和測(cè)量體型，從它身上抽血并將其放入多個(gè)樣本管。對(duì)于在黃石公園合作研究狼的生物學(xué)家、遺傳學(xué)家和疾病生態(tài)學(xué)家團(tuán)隊(duì)來說，302M的血液可能是液體黃金，就像多年來所有其他狼的血液樣本一樣。這些血液不僅提供了302M的營(yíng)養(yǎng)、激素和基本健康狀況以及他所接觸的各種疾病的快照，而且還產(chǎn)生了他生命的遺傳密碼--他的DNA。本章詳細(xì)介紹了分子遺傳技術(shù)在黃石狼研究中的應(yīng)用。但首先，我們要回顧一下基本的生物學(xué)原理，當(dāng)像302M這樣的狼帶著它特有的犬科動(dòng)物特征進(jìn)入我們的視野時(shí)，我們到底在看什么。

狼的身體構(gòu)造是由數(shù)以萬億計(jì)的細(xì)胞組合而成的。這些細(xì)胞中的每一個(gè)（除了少數(shù)例外）都包含相同的基因組，由兩股復(fù)雜的DNA組成，由核苷酸對(duì)組成的鏈子構(gòu)成。在302M的大多數(shù)細(xì)胞中，每個(gè)細(xì)胞核包含39對(duì)染色體（人類有23對(duì)）。這些染色體承載著302M這個(gè)生物體的藍(lán)圖，即狼。黃石公園狼的血統(tǒng)告訴我們，302M從它的母親7F那里得到了一套39條染色體，另一套39條染色體來自它的父親，利奧波德狼群的2M。每套39條染色體包含約19,000個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，代表近30億個(gè)堿基對(duì)的DNA，其中大部分在其他哺乳動(dòng)物，包括我們身上都有相似的基因。這種生物材料代表了302M的遺傳成分，或他的基因型。它的基因?yàn)樘囟ǖ牡鞍踪|(zhì)編碼，這些蛋白質(zhì)在各個(gè)細(xì)胞中表達(dá)，并為它的特征提供生物編碼，如它的皮毛的黑色，它的身體大小，以及它在犬瘟熱爆發(fā)時(shí)的生存潛力。從302M被父母懷上的那一刻起，到我們看到它在冰凍的黃石湖上小跑的那一天（圖7.1），它可觀察到的特征，或稱表型，都是它的基因在其組織和器官的細(xì)胞中不同表達(dá)的結(jié)果。重要的是，他的表現(xiàn)型是他的基因與周圍環(huán)境相互作用的產(chǎn)物。從他在子宮內(nèi)開始與他的胎兒一起成長(zhǎng)，到他參加的體力要求很高的馬鹿狩獵，再到他在領(lǐng)地爭(zhēng)奪戰(zhàn)中面臨的挑戰(zhàn)和回報(bào)，302M的基因表達(dá)了它們的潛能，以示回應(yīng)。這些基因與環(huán)境的相互作用使每只狼成為獨(dú)特的個(gè)體。這個(gè)例子，簡(jiǎn)而言之，不僅描述了狼的基本生物框架，而且描述了地球上所有的生命。有了這個(gè)關(guān)于狼的遺傳構(gòu)成的基本描述，本章將概述遺傳學(xué)在黃石公園狼的故事中所扮演的角色，以及它們對(duì)不斷進(jìn)步的分子研究領(lǐng)域的前沿貢獻(xiàn)。

溫泉之源：狼的分子遺傳學(xué)研究方法

在黃石公園消滅狼后的近四十年里，在下間歇泉盆地發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的微生物物種，徹底改變了分子生物學(xué)的世界（Guyer和Koshland 1989年；Varley 1993年）。這個(gè)微生物物種是一種喜熱的細(xì)菌，即水生熱菌，它產(chǎn)生一種被稱為Taq聚合酶的熱穩(wěn)定酶。Taq聚合酶的非凡之處在于，它使科學(xué)家能夠在實(shí)驗(yàn)室里通過一系列簡(jiǎn)單的步驟，包括加熱和冷卻DNA，大規(guī)模地復(fù)制DNA。只有適應(yīng)溫泉環(huán)境的細(xì)菌才能產(chǎn)生這種熱穩(wěn)定的聚合酶，并在這些劇烈的溫度波動(dòng)中進(jìn)化。Taq聚合酶作為年度分子（1989年）登上了《科學(xué)》雜志的封面（Guyer和Koshland 1989年），Taq聚合酶、相關(guān)產(chǎn)品和設(shè)備的商業(yè)銷售創(chuàng)造了數(shù)十億美元的收入。使用Taq聚合酶的DNA擴(kuò)增過程（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或PCR）的發(fā)明者Kary Mullis于1993年被授予諾貝爾獎(jiǎng)。自20世紀(jì)80年代以來，PCR已經(jīng)徹底改變了法醫(yī)、人類醫(yī)學(xué)、傳染病以及分子和群體遺傳學(xué)領(lǐng)域。在一連串引人入勝的事件中，一個(gè)適應(yīng)黃石公園嚴(yán)酷地?zé)崴虻牟黄鹧鄣奈锓N的發(fā)現(xiàn)，為生命樹上的許多生物打開了科學(xué)調(diào)查的大門，并強(qiáng)調(diào)了生物多樣性對(duì)人類社會(huì)的重要性。

除了對(duì)我們自己物種的明顯好處外，我們不需要再去看犬科（包括狼、狗、郊狼、胡狼和狐貍的家族），就可以看到這種分子技術(shù)是如何促進(jìn)我們對(duì)生態(tài)學(xué)、演化與保護(hù)的理解的。從解開類似狼的犬科動(dòng)物的復(fù)雜演化歷史和狗的馴化起源，到揭示基因的結(jié)構(gòu)和功能，再到解決對(duì)犬科動(dòng)物保護(hù)有意義的問題，很少有非人類物種像犬科動(dòng)物那樣處于遺傳研究的前沿。此前，Wayne和Vilà發(fā)表了對(duì)狼的遺傳研究的初步分子方法的全面分析（Wayne和Vilà 2003），而Wayne（2010）綜合了類狼犬科的種群遺傳學(xué)的最新進(jìn)展。后者強(qiáng)調(diào)了21世紀(jì)基因組學(xué)革命的應(yīng)用及其與狗基因組計(jì)劃的關(guān)聯(lián)（LindbladToh等人，2005；Kohn等人，2006），這促進(jìn)了新分子標(biāo)記和分析技術(shù)的發(fā)展。將傳統(tǒng)的和新出現(xiàn)的分子技術(shù)應(yīng)用于黃石國(guó)家公園狼的研究，使這個(gè)種群處于一個(gè)特別明亮的聚光燈下。

黃石國(guó)家公園狼的遺傳工作開始于在它們被釋放到野外之前收集每個(gè)創(chuàng)始個(gè)體的DNA樣本。在這之后，建立了一個(gè)對(duì)創(chuàng)始者的數(shù)百個(gè)后代的采樣協(xié)議。從一開始，我們就努力從所有在捕捉和無線電追蹤活動(dòng)中處理過的狼身上采集血液（圖7.2），以及從所有回收的狼的遺骸上采集組織。從所有這些樣本中提取DNA并儲(chǔ)存起來，用于各種分子應(yīng)用。除了這種基因采樣，狼計(jì)劃團(tuán)隊(duì)一直致力于收集各種種群學(xué)、生命史、形態(tài)學(xué)、行為學(xué)、疾病和生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)集。對(duì)任何野生物種來說，在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)整合如此豐富的數(shù)據(jù)是很少見的，更不用說對(duì)一個(gè)由已知?jiǎng)?chuàng)始者及其后代組成的重新引入的種群。

在過去的二十年里，分子工具和技術(shù)的進(jìn)步，以及它們?cè)谏鷳B(tài)學(xué)、演化學(xué)和行為學(xué)研究中的應(yīng)用，得到了極大的發(fā)展。自從狼群回到黃石國(guó)家公園后，我們使用各種分子標(biāo)記和方法評(píng)估了個(gè)體的基因型。我們利用PCR技術(shù)對(duì)個(gè)體從父母那里繼承的核DNA進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，對(duì)核基因組中被稱為微衛(wèi)星位點(diǎn)的短重復(fù)DNA片段和單核苷酸多態(tài)性（簡(jiǎn)稱SNPs）進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序。微衛(wèi)星通常是高度可變的，對(duì)于解決最近的種群動(dòng)態(tài)，如狼之間的親緣關(guān)系和擴(kuò)散模式極為有用。這些信息被用來通過親子關(guān)系的分配來估計(jì)繁殖成功率。然而，使用這種重復(fù)性DNA的一個(gè)缺點(diǎn)是，它在可以調(diào)查的基因組的比例方面是有限的。通常，一項(xiàng)研究只包括8-40個(gè)基因座，這是基因組的一個(gè)極小的部分。這就限制了對(duì)演化化模式、復(fù)雜的種群結(jié)構(gòu)、甚至像狼這樣的密切親屬結(jié)構(gòu)的種群的親子關(guān)系作出推斷的能力。在黃石公園也對(duì)狼的SNP位點(diǎn)的變化進(jìn)行了調(diào)查。SNP是在一個(gè)種群中分離等位基因（基因的變異形式）的可變位點(diǎn)，可以在整個(gè)基因組中進(jìn)行基因分型。SNP基因分型可以提供有關(guān)基因組區(qū)域的有價(jià)值的信息，這些區(qū)域包含與適應(yīng)性有關(guān)的最新變化或在長(zhǎng)期演化過程中穩(wěn)定地保存下來。最后，黃石公園的狼的基因組測(cè)序已經(jīng)成為對(duì)科學(xué)的一個(gè)重要貢獻(xiàn)。通過這種方式，我們可以掃描整個(gè)近30億個(gè)核苷酸的集合，解決類似的問題，但分辨率更深。這種方法還允許對(duì)那些在個(gè)體所面臨的特定生物或環(huán)境條件下表達(dá)或轉(zhuǎn)錄的基因進(jìn)行測(cè)序?？傊@些遺傳標(biāo)記使我們能夠探索從種群結(jié)構(gòu)和基因流到血統(tǒng)關(guān)系、被毛顏色的動(dòng)態(tài)、生活史策略和基因組的自然選擇等問題。

從血統(tǒng)到種群結(jié)構(gòu)

推斷黃石狼的家譜關(guān)系的能力引起了廣大公眾和科學(xué)家的共鳴，他們?cè)噲D利用家譜的信息力量。正如許多人通過家譜與自己的人類祖先聯(lián)系起來一樣，成千上萬的人通過連接個(gè)人多代的家庭關(guān)系來慶祝黃石狼的遺產(chǎn)。這些親屬關(guān)系中的許多可以通過實(shí)地觀察積累的機(jī)構(gòu)知識(shí)來推斷。例如，在2月份對(duì)特定的繁殖對(duì)進(jìn)行觀察，然后是雌性的懷孕、筑巢和幼崽的哺乳，這些具體的行為觀察可以可靠地表明親子關(guān)系。然而，有時(shí)這種知識(shí)對(duì)于存在復(fù)雜繁殖行為的群體來說是不精確的，或者是無法獲得觀察數(shù)據(jù)的群體。在這里，基于分子分析的力量被用來測(cè)試?yán)侨褐g的遺傳關(guān)系。在黃石國(guó)家公園，將實(shí)地觀察的信息與遺傳數(shù)據(jù)相結(jié)合，對(duì)于破譯狼群的譜系關(guān)系至關(guān)重要。

第一個(gè)關(guān)于黃石狼的開創(chuàng)性遺傳研究使用了26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型來評(píng)估200個(gè)個(gè)體的遺傳關(guān)系，并推斷親子關(guān)系、繁殖對(duì)特征和狼群結(jié)構(gòu)的模式（vonHoldt等，2008）。根據(jù)微衛(wèi)星數(shù)據(jù)，我們重建了一個(gè)種群譜系，將創(chuàng)始人與他們的許多后代聯(lián)系起來，直到恢復(fù)的第一個(gè)十年。這種重建使我們能夠評(píng)估狼群形成和解體的細(xì)節(jié)，并確定狼群之間的親屬關(guān)系。了解狼的譜系結(jié)構(gòu)如何影響行為、種群和遺傳變異，也為評(píng)估瀕危物種恢復(fù)的成功提供了一個(gè)難得的機(jī)會(huì)。vonHoldt等人（2008）的工作發(fā)現(xiàn)，在恢復(fù)的第一個(gè)十年里，隨著狼種群的擴(kuò)大，狼保持了高水平的遺傳變異和低水平的近親繁殖。

狼群恢復(fù)的遺傳成功有賴于幾個(gè)因素。首先，創(chuàng)始種群是相對(duì)較大的，而且在遺傳上具有多樣性，因?yàn)樗▉碜约幽么髢蓚€(gè)來源種群的不同狼群的個(gè)體，以及來自蒙大拿州西北種群的混血。我們可以看看其他狼群所面臨的遺傳挑戰(zhàn)，如皇家島、斯堪的納維亞半島和美國(guó)西南部的狼種群，這些狼種群是由少數(shù)創(chuàng)始個(gè)體建立的（Wayne等人，1991；Hedrick等人，1997；Liberg等人，2005）。因此，這些種群的近親繁殖導(dǎo)致了較低的遺傳多樣性和個(gè)體健身損失，其結(jié)果是種群表現(xiàn)較差。狼的這種模式反映了一些動(dòng)物和植物種群的數(shù)據(jù)，表明近親繁殖會(huì)對(duì)生存、繁殖以及對(duì)疾病和環(huán)境壓力的抵抗力產(chǎn)生負(fù)面影響（Keller and Waller 2002）。這些負(fù)面影響主要是由于當(dāng)近親繁殖時(shí)，有害的隱性性狀和有害的基因會(huì)有更大的機(jī)會(huì)表現(xiàn)出來。從足夠數(shù)量的多樣化和沒有親緣關(guān)系的創(chuàng)始狼開始，可以最大限度地減少新建立的狼種群面臨的遺傳挑戰(zhàn)。

除了具有遺傳多樣性的基礎(chǔ)種群外，遺傳變異的維持還取決于各種避免近親繁殖的行為機(jī)制。親屬識(shí)別和避免近親繁殖的選擇被認(rèn)為在生活在家庭群體或合作繁殖的物種中更為發(fā)達(dá)（Pusey和Wolf 1996）。事實(shí)上，對(duì)黃石公園狼繁殖對(duì)的遺傳關(guān)系分析表明，狼盡可能避免與親屬交配（vonHoldt等人，2008），Smith等人（1997）對(duì)德納利國(guó)家公園和蘇必利爾國(guó)家森林的近親狼種群也發(fā)現(xiàn)了這一點(diǎn)。鑒于狼的社會(huì)結(jié)構(gòu)，個(gè)體更有可能在其出生的群體內(nèi)遇到近親，而更有可能在出生群體外遇到無親緣關(guān)系的個(gè)體（Geffen等人，2011）。因此，對(duì)于狼和其他社會(huì)性物種來說，遠(yuǎn)離母群的擴(kuò)散在一定程度上反映了在避免與親屬近親繁殖的同時(shí)獲得配偶的適應(yīng)性反應(yīng)（Greenwood 1980; Pusey and Wolf 1996）。黃石公園的遺傳和行為學(xué)工作表明，近親繁殖的避免是通過各種擴(kuò)散、繁殖策略和群體形成模式來實(shí)現(xiàn)的（vonHoldt等人，2008）。具體來說，vonHoldt等人（2008）的工作提供了一個(gè)新的視角，即一個(gè)瀕危食肉動(dòng)物恢復(fù)的社會(huì)集合規(guī)則。在這里，我們可以追蹤最初的繁殖對(duì)的建立，以及因此而形成的新的繁殖對(duì)和群體的規(guī)則。隨著種群和景觀上繁殖者數(shù)量的增加，近親繁殖的避免和成功繁殖的群體的建立在恢復(fù)的最初十年里保持了高遺傳多樣性。

重要的是要記住，黃石國(guó)家公園的狼并不代表單一的、孤立的種群。相反，它們是大黃石生態(tài)系統(tǒng)種群的一部分，而大黃石種群只是落基山脈更大種群中的一個(gè)部分。撇開保護(hù)和生態(tài)目標(biāo)不談，長(zhǎng)期的遺傳生存能力依賴于這一事實(shí)。遺傳連接性是落基山脈北部狼剔除的主要規(guī)定之一（USFWS 1994a, 2008）。這是因?yàn)檫z傳多樣性的亞種群保持著足夠的規(guī)模，并通過擴(kuò)散連接起來，對(duì)與近親繁殖、小規(guī)模和隔離有關(guān)的健康成本更有彈性，并能更好地適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件（Keller和Waller 2002）。為了評(píng)估重新引入后洛磯山脈北部是否存在一個(gè)遺傳多樣性的亞種群網(wǎng)絡(luò)，我們使用分子技術(shù)分析了555只洛磯山脈北部狼的DNA樣本，包括愛達(dá)荷州和黃石國(guó)家公園的所有66只重新引入的創(chuàng)始者。與黃石公園的研究一樣，vonHoldt等人（2010）利用恢復(fù)初期十年間26個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的變異來證明，落基山狼作為一個(gè)整體保持了高水平的遺傳變異，近親繁殖水平較低。與在黃石國(guó)家公園發(fā)現(xiàn)的因素相似，如多樣化的創(chuàng)始種群、快速的種群增長(zhǎng)和近親繁殖的避免，影響了這些模式。

此外，整個(gè)落基山脈的狼顯示出遺傳模式或遺傳結(jié)構(gòu)，這在很大程度上確定了個(gè)體來自于它們被采樣的特定恢復(fù)區(qū)（即大黃石地區(qū)、愛達(dá)荷州中部、蒙大拿州西北部）。總的來說，三個(gè)恢復(fù)區(qū)的狼之間的區(qū)別很快就形成了，盡管它們是來自加拿大類似的源種群。這種遺傳結(jié)構(gòu)，以及來自血統(tǒng)、親屬關(guān)系分析和獨(dú)特的等位基因的信息，使研究人員能夠檢測(cè)到恢復(fù)區(qū)之間的擴(kuò)散事件和個(gè)體的繁殖（vonHoldt等人，2010）。vonHoldt等人(2010)的研究發(fā)現(xiàn)了21個(gè)移民，在所有三個(gè)恢復(fù)區(qū)發(fā)現(xiàn)了混雜的個(gè)體(移民的后代)，并證明了在恢復(fù)的第一個(gè)十年中基因上有效的擴(kuò)散(即在擴(kuò)散后繁殖的個(gè)體)。vonHoldt等人（2010）利用血統(tǒng)和親緣關(guān)系數(shù)據(jù)來識(shí)別家族群體（父母-后代和兄弟姐妹），并將這些血統(tǒng)追溯到源種群，估計(jì)在三個(gè)恢復(fù)區(qū)中，每一代至少有5.4個(gè)有效擴(kuò)散者。對(duì)于該地區(qū)的狼來說，狼的世代時(shí)間，即兩個(gè)連續(xù)的世代之間的平均時(shí)間是4.2年。

然而，遷移并沒有在恢復(fù)區(qū)之間均勻地發(fā)生。例如，從愛達(dá)荷州中部擴(kuò)散到大黃石生態(tài)系統(tǒng)，導(dǎo)致在懷俄明州公園東南部發(fā)現(xiàn)擴(kuò)散者（和混雜的后代），但在蒙大拿州西北部和黃石地區(qū)之間沒有發(fā)現(xiàn)擴(kuò)散者的交流。此外，在恢復(fù)的第一個(gè)十年中，沒有發(fā)現(xiàn)有效的擴(kuò)散到黃石國(guó)家公園。在懷俄明州采樣的6個(gè)混血個(gè)體中，有4個(gè)與來自愛達(dá)荷州的擴(kuò)散狼B58有明顯關(guān)系，后者在黃石公園的東南方向定居。在本研究期間，黃石公園內(nèi)的高狼密度和領(lǐng)地飽和度可能限制了個(gè)體有效地?cái)U(kuò)散到這個(gè)核心區(qū)域的能力（vonHoldt等人，2008）。在黃石公園外，由于人類的影響，狼的生存率和狼群穩(wěn)定性較低（Smith等人，2010），建立領(lǐng)地和尋找繁殖位空缺的機(jī)會(huì)可能更大。盡管整個(gè)地區(qū)的擴(kuò)散模式有些不對(duì)稱，但對(duì)基因流的最低估計(jì)表明，遺傳連接的水平足以確保遺傳健康的維持。鑒于狼的高擴(kuò)散能力以及相對(duì)于其他處于危險(xiǎn)中的脊椎動(dòng)物物種而言，它們對(duì)自然和人為死亡因素的人口彈性（Mech and Boitani 2003b），這一發(fā)現(xiàn)并不令人驚訝。然而，這項(xiàng)研究通過分子遺傳學(xué)的范圍為狼的景觀生態(tài)學(xué)提供了巨大的洞察力，為將來評(píng)估遺傳結(jié)構(gòu)和連接性提供了一個(gè)基線和方法。

由于這項(xiàng)分析只涵蓋了落基山脈北部狼種群恢復(fù)的第一個(gè)十年，目前的遺傳狀況還不清楚。但鑒于2015年的狼群估計(jì)至少有1700只，是研究期結(jié)束時(shí)的兩倍多，因此，目前整個(gè)地區(qū)可能正在發(fā)生更大的基因流動(dòng)。我們還記錄了更多遷移到公園的案例，并有一些成功繁殖的證據(jù)（例如，8英里狼群的創(chuàng)始者）。這些事件可能是由于過去十年公園內(nèi)狼的密度較低，這可能使黃國(guó)家石公園的“狼堡”更容易被擴(kuò)散者攻破。歸根結(jié)底，北落基山狼的遺傳健康的特點(diǎn)可以歸結(jié)為最初的重新引入規(guī)劃、低水平的近親繁殖和種群擴(kuò)張。美國(guó)西部狼的長(zhǎng)期生存管理將需要維持足夠的種群規(guī)模和自然擴(kuò)散的動(dòng)態(tài)。成功與否將部分取決于狼的死亡率，這在很大程度上受到人類和棲息地條件的影響（Oakleaf等人，2006；Murray等人，2010；Smith等人，2010）。但是，成功已經(jīng)并將繼續(xù)受到像黃石國(guó)家公園這樣大規(guī)模、高質(zhì)量的生態(tài)系統(tǒng)和其他適宜的美國(guó)和加拿大的生境的影響--以及這些讓狼成為真正的狼。鑒于很少有瀕危物種的重新引入能夠成功（Wolf等人，1996年；Fischer和Lindenmayer，2000年），黃石國(guó)家公園合作小組的工作是首次評(píng)估高度成功的重新引入的遺傳后果?？偟膩碚f，它的發(fā)現(xiàn)對(duì)保護(hù)遺傳學(xué)和瀕危物種恢復(fù)領(lǐng)域是一個(gè)寶貴的貢獻(xiàn)（vonHoldt等人，2008；vonHoldt等人，2010）。

從生命史到演化史

除了這些DNA樣本和譜系的最初應(yīng)用，黃石公園的狼對(duì)分子生物學(xué)和演化動(dòng)力學(xué)的廣泛的新興課題做出了貢獻(xiàn)，從與健身有關(guān)的特征的遺傳基礎(chǔ)到犬科動(dòng)物的演化。這些狼的樣本繼續(xù)為科學(xué)服務(wù)。為了探索狼對(duì)環(huán)境變化的潛在生態(tài)和演化反應(yīng)，Coulson等人（2011年）利用經(jīng)典的種群遺傳學(xué)和數(shù)學(xué)模型，這些模型使用了關(guān)于個(gè)體性狀（如毛色和體型）如何影響生存、生長(zhǎng)和繁殖等生命率的信息。這項(xiàng)研究不僅為迷人的毛色故事做出了貢獻(xiàn)（見本卷第8章），而且證明了先進(jìn)的理論模型的應(yīng)用，該模型以長(zhǎng)期的狼群數(shù)據(jù)為參數(shù)，預(yù)測(cè)對(duì)環(huán)境變化的復(fù)雜生態(tài)和演化反應(yīng)。

在深入探索過去的過程中，研究人員利用以一些黃石國(guó)家公園狼為代表的狼的基因組，獲得了對(duì)我們北美犬科動(dòng)物復(fù)雜歷史的洞察力。演化研究的一個(gè)核心目標(biāo)是揭開密切相關(guān)物種群體的復(fù)雜歷史，而犬科被證明是最具挑戰(zhàn)性的一個(gè)。當(dāng)許多保護(hù)工作致力于了解瀕危犬科動(dòng)物（如紅狼）的獨(dú)特遺傳歷史時(shí)，來自黃石公園狼的數(shù)據(jù)已經(jīng)成為一個(gè)可靠的參考。它們?yōu)榭茖W(xué)家提供了一個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的灰狼基因組，可用于評(píng)估犬科動(dòng)物的祖先和獨(dú)特的演化關(guān)系。vonHoldt及其同事（2011年）使用類似于流行的商業(yè)郵購(gòu)祖先測(cè)試的方法，使用分布在基因組上的SNPs來創(chuàng)建北美犬科的第一個(gè)祖先分析。他們發(fā)現(xiàn)，通過使用西部郊狼和黃石狼作為祖先參考，北美犬類已經(jīng)進(jìn)行了幾百代的基因交換，代表了一個(gè)獨(dú)特的物種復(fù)合體。最近，黃石狼提供了完整的基因組序列，幫助科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，雖然灰狼和郊狼代表了長(zhǎng)期分化的北美血統(tǒng)，但東加拿大狼（Canis lycaon）和紅狼（Canis rufus）代表了這兩個(gè)物種的獨(dú)特混合物（vonHoldt等人，2016）。

我們自己的物種與犬科動(dòng)物有著復(fù)雜的進(jìn)化史?；依鞘俏覀冏钣H密的動(dòng)物伙伴--家犬的近親（例如，Vilà等人，1999）。自從大約4萬年前從灰狼馴化而來（Freedman等人，2014年），人類通過人工選擇和嚴(yán)格的繁殖計(jì)劃極大地改變了這種犬科動(dòng)物的表型。黃石狼的基因組序列在對(duì)其歷史的研究中起到了核心作用。在馴化野生狼的過程中，最吸引人和最復(fù)雜的變化之一是行為上的變化：家犬對(duì)人類的友好和交流行為與它的野生祖先狼的行為明顯不同。這種行為上的差異促使科學(xué)家們假設(shè)，有一些重要的遺傳成分塑造了犬類的個(gè)性，這可能有助于將野狼馴化為馴服的狗的過程。最近的研究發(fā)現(xiàn)，犬科動(dòng)物基因組的一個(gè)區(qū)域的變化與狗和狼的人類指導(dǎo)的社會(huì)行為有關(guān)（vonHoldt等人，2017）。有趣的是，在這一基因組區(qū)域的人類對(duì)應(yīng)物中，以及在與人類先天性疾病?“威廉姆斯-伯倫綜合征?"相關(guān)的可變性格中，都發(fā)現(xiàn)了與犬科動(dòng)物對(duì)應(yīng)物驚人的相似度，其特征是極度好客等超社會(huì)行為。這些突變并不是家犬所獨(dú)有的；相反，它們?cè)谑澜绺鞯氐母鞣N灰狼種群中都能找到，包括黃石公園的狼。這些突變可能為了解家犬的復(fù)雜馴化歷史提供了一個(gè)關(guān)鍵的視角，可能揭示了突變的古老起源，這些突變?yōu)槿祟愄峁┝伺c超社會(huì)性但毫無戒心的狼交好的能力。隨著演化時(shí)間的推移，這種基因遺產(chǎn)可能是創(chuàng)造人類最忠實(shí)和最旺盛的伙伴的一個(gè)關(guān)鍵因素。

黃石公園的狼譜系也被用來計(jì)算某些性狀的遺傳率水平，即個(gè)體的性狀與父母的相同性狀的相關(guān)程度。當(dāng)一個(gè)個(gè)體的性狀與其父母的性狀有很大差異時(shí)，就意味著環(huán)境的影響，而不是純粹的遺傳因素，對(duì)整個(gè)性狀或表型的影響。然而，在實(shí)踐中，要區(qū)分基因和環(huán)境對(duì)產(chǎn)生表型的影響是非常困難的。對(duì)野生種群遺傳率的許多估計(jì)都依賴于兄弟姐妹之間的比較，眾所周知，兄弟姐妹共享50%的基因。然而，兄弟姐妹往往也有許多共同的環(huán)境因素，事實(shí)證明，要區(qū)分兩者是非常困難的。黃石公園的狼種群是獨(dú)特的，不僅其譜系被廣泛記錄，而且正在進(jìn)行的研究也廣泛地量化了基因分型的狼的生態(tài)和社會(huì)條件，這可以被整合到遺傳率的計(jì)算中，以更好地了解遺傳和環(huán)境對(duì)性狀的相對(duì)貢獻(xiàn)。例如，利用正在進(jìn)行的狼的攻擊性行為研究的數(shù)據(jù)，我們利用譜系來估計(jì)個(gè)體在包間互動(dòng)中會(huì)表現(xiàn)出的攻擊性水平的遺傳性（vonHoldt等人，2020）（圖7.3）。我們的遺傳性分析顯示，僅僅考慮遺傳學(xué)不足以解釋這種復(fù)雜的行為特征。相反，我們發(fā)現(xiàn)，攻擊性受到遺傳學(xué)和養(yǎng)狼的社會(huì)和物理環(huán)境的錯(cuò)綜復(fù)雜的影響。我們還可以應(yīng)用這些研究策略來探索分子對(duì)一系列廣泛的性狀的影響，如疾病易感性、體型和社會(huì)地位。

狼的基因功能

人們普遍認(rèn)為，遺傳變異是適應(yīng)環(huán)境挑戰(zhàn)和生存的關(guān)鍵，如氣候變化、疾病爆發(fā)、捕食者或獵物多樣性的變化。對(duì)于跨代發(fā)生的變化來說，這可能是正確的，但個(gè)體一生中的適應(yīng)機(jī)制涉及基因表達(dá)。每當(dāng)我們吃飯、睡覺、運(yùn)動(dòng)或放松時(shí)，一組精選的基因就會(huì)被打開或關(guān)閉，就像一個(gè)分子開關(guān)；這種機(jī)制對(duì)日常生存至關(guān)重要，是對(duì)生活挑戰(zhàn)（如紛爭(zhēng)、饑餓或疾病）的一種回應(yīng)。然而，我們?cè)诤艽蟪潭壬蠈?duì)基因表達(dá)反應(yīng)的規(guī)模及其在自然系統(tǒng)中的限制一無所知。盡管實(shí)驗(yàn)室的小鼠種群是在高度控制的環(huán)境中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的理想選擇，但研究結(jié)果往往只限于特定的情況和條件。越來越多的研究正在使用黃石國(guó)家公園狼的DNA，以及現(xiàn)在的RNA，以獲得對(duì)野生自然種群中基因組功能的洞察。這兩種類型的分子讓我們了解到涉及控制基因表達(dá)的分子開關(guān)的兩個(gè)不同過程。

來自黃石國(guó)家公園狼群的DNA已被用于研究DNA上發(fā)現(xiàn)的化學(xué)修飾，這些修飾調(diào)節(jié)著基因表達(dá)的時(shí)間和地點(diǎn)，被稱為表觀遺傳學(xué)。這些修飾是表型或基因表達(dá)的可遺傳變化，而不是由于DNA序列的變化。基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)對(duì)正常的細(xì)胞功能和發(fā)育很重要，因此對(duì)個(gè)人的健康也很重要（Jones?和?Takai 2001）。在人類中，這種調(diào)節(jié)功能的失調(diào)是許多疾病的特征，包括癌癥（Jones和Laird 1999）?；瘜W(xué)修飾的一種類型是在核苷酸胞嘧啶上添加一個(gè)小的甲基（CH3），這一過程稱為甲基化。這種基團(tuán)的加入就像一個(gè)開關(guān)，可以關(guān)閉局部基因的表達(dá)。然而，缺乏這些化學(xué)基團(tuán)實(shí)質(zhì)上是?"開?"的開關(guān)，導(dǎo)致基因的表達(dá)。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的新進(jìn)展，現(xiàn)在可以對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序，識(shí)別每個(gè)胞嘧啶，并確定它是否被甲基化。這種信息，超越了傳統(tǒng)的遺傳研究，現(xiàn)在可以告訴我們關(guān)于基因表達(dá)的當(dāng)前和動(dòng)態(tài)狀態(tài)，以及個(gè)體狼是如何應(yīng)對(duì)其環(huán)境的，從壓力到營(yíng)養(yǎng)到疾病和行為。在對(duì)社會(huì)性犬類進(jìn)行的首次此類研究中，Janowitz Koch等人（2016年）調(diào)查了黃石國(guó)家公園35只純種狼的甲基化狀態(tài)，并估計(jì)了這種模式的遺傳性，這對(duì)野生動(dòng)物來說是一個(gè)獨(dú)特的機(jī)會(huì)。這項(xiàng)研究揭示了灰狼和家犬之間甲基化的深度保守差異，表明存在狼和狗的特定基因表達(dá)模式，可以告訴我們更多關(guān)于這些犬類如何進(jìn)化出它們的差異。繼續(xù)研究將探索與狼的成長(zhǎng)、壓力以及與周圍世界的相互作用有關(guān)的甲基化變化。對(duì)犬科動(dòng)物的表觀遺傳學(xué)研究，就像對(duì)人類的研究一樣，將繼續(xù)讓我們了解生物體的基因是如何被控制的，個(gè)體的生活活動(dòng)如何影響基因作用和健康，以及累積起來，是什么讓個(gè)體變得獨(dú)特。

第二類分子是RNA--通常包含制造蛋白質(zhì)的指令的短暫分子。從2008年開始，探索狼的基因表達(dá)的努力涉及一個(gè)全新的收集方案（Oster等人，2011年）。在黃石公園活捉的狼的血液被抽到旨在收集RNA的樣品管中，RNA反映了目前正在表達(dá)的基因。這些狼是第一批使用下一代RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)其基因表達(dá)進(jìn)行表征的野生脊椎動(dòng)物之一。利用這些技術(shù)，我們調(diào)查了諸如性別、年齡、等級(jí)和疥癬感染等因素是否會(huì)導(dǎo)致不同的基因表達(dá)模式（Charruau等人，2016）。我們表明，在模式物種和人類中支配基因表達(dá)的因素，如性別和支配等級(jí)，對(duì)狼的基因表達(dá)沒有強(qiáng)烈影響。這一發(fā)現(xiàn)可能反映了狼社會(huì)的高度合作和整合性，以及等級(jí)和年齡之間的相關(guān)性。我們也沒有發(fā)現(xiàn)感染疥癬的狼和健康的狼有明顯不同的表達(dá)模式。然而，有一些證據(jù)表明，與疥癬有關(guān)的5個(gè)基因可能在其宿主中喚起免疫抑制特性。絕大多數(shù)情況下，狼的基因表達(dá)特征反而與年齡有關(guān)。狼的年老速度很快，因?yàn)榇蠖鄶?shù)個(gè)體在6歲前就已經(jīng)死亡，并且在這一時(shí)期顯示出極度的傷害和疾病的證據(jù)。與這種衰老速度相匹配的是基因表達(dá)衰老的速度也同樣快，因此，一只6歲的狼在基因表達(dá)方面經(jīng)歷了與老年人類一樣多的變化，而且是在一個(gè)類似的基因子集上。這些結(jié)果顯示，盡管狼和人類的生命史和環(huán)境存在巨大差異，但它們的衰老模式在演化上是保守的，如免疫系統(tǒng)和新陳代謝的惡化。這項(xiàng)工作不僅為在家犬中觀察到的衰老和疾病模式提供了演化方面的洞察力，而且為今后在不斷變化的環(huán)境中和以人類為主的景觀中對(duì)狼的研究建立了關(guān)鍵的基線。此外，它還為其他野生脊椎動(dòng)物的類似研究提供了一個(gè)新的先例和協(xié)議。

狼和基因組學(xué)的時(shí)代

我們已經(jīng)進(jìn)入了基因組學(xué)時(shí)代，目前的分子技術(shù)使科學(xué)家能夠研究生物體內(nèi)的整套遺傳物質(zhì)。狼一直處于野生物種基因組學(xué)工作的前沿，已經(jīng)描述了舊世界狼的10多個(gè)基因組（Freedman等人，2014；Zhang等人，2014）。由于高通量DNA測(cè)序和計(jì)算機(jī)生成的生物信息學(xué)的力量，黃石國(guó)家公園的狼現(xiàn)在已經(jīng)成為北美狼基因組的主要代表。事實(shí)證明，狼的基因組在定義狼的診斷性標(biāo)記方面是非常有價(jià)值的，可以用來探測(cè)與家犬和郊狼的混雜情況（例如，vonHoldt等人，2013）。完整的基因組也可用于更準(zhǔn)確地估計(jì)突變率--這一數(shù)值使科學(xué)家能夠模擬有利和有害的變異如何在種群中積累（Marsden等人，2016），并更好地理解對(duì)各種性狀的選擇。

最近，我們已經(jīng)完成了本章開頭所描述的302M的基因組測(cè)序，以及他的六個(gè)狼群伙伴，包括他的配偶（569F）和她的后代。對(duì)于這些狼，我們有很高的測(cè)序分辨率（每個(gè)核苷酸大約覆蓋25倍），以及它們之間已知的血統(tǒng)關(guān)系。有趣的是，這個(gè)血統(tǒng)的家族結(jié)構(gòu)揭示了野外灰狼一胎多父的第一個(gè)確認(rèn)案例。2006年，569F是德魯伊峰狼群的一只從屬繁殖雌狼，它產(chǎn)下的一窩狼包含了從屬繁殖雄狼302M（子代570M）和優(yōu)勢(shì)繁殖雄狼480M（子代629M和694F）的基因型后代。

利用這些狼的基因組序列和血統(tǒng)關(guān)系，Koch等人（2019年）對(duì)野生狼的突變率進(jìn)行了直接估計(jì)，這個(gè)數(shù)值是確定基因進(jìn)化率和選擇如何改變基因組的基本參數(shù)。除了小鼠的一項(xiàng)研究外，這項(xiàng)研究提供了靈長(zhǎng)類動(dòng)物以外的唯一直接的哺乳動(dòng)物突變率。然后，這個(gè)突變率被用來估計(jì)犬科動(dòng)物人口史上的一個(gè)關(guān)鍵事件的時(shí)間，具體來說，就是狗和歐亞狼的祖先種群之間的分歧時(shí)間，其時(shí)間在25000年到33000年前。

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結(jié)論

遺傳學(xué)研究的進(jìn)展正在繼續(xù)加強(qiáng)我們對(duì)生物學(xué)基本原理的理解。從生命演化史的綜合模型的可能性到破譯人類疾病和健康的遺傳基礎(chǔ)，遺傳學(xué)進(jìn)步的承諾是令人興奮的，如果不是壓倒性的。考慮到科學(xué)發(fā)現(xiàn)的漸進(jìn)性，我們可以把具有豐富遺傳研究歷史的狼作為這一領(lǐng)域的重要貢獻(xiàn)者（Wayne和Vilà，2003年；vonHoldt等人，2010年）。但是，除了為科學(xué)而科學(xué)之外，狼研究的貢獻(xiàn)在保護(hù)方面也有重要的應(yīng)用。人類活動(dòng)的影響已經(jīng)從根本上改變了世界各地的自然空間，而且在未來會(huì)更加嚴(yán)重。這種影響將不成比例地影響到大型食肉動(dòng)物，因此為這些物種建立遺傳基線，并開發(fā)預(yù)測(cè)工具，以校準(zhǔn)和預(yù)測(cè)它們?cè)谖磥淼倪z傳反應(yīng)，是至關(guān)重要的。涉及黃石公園狼的遺傳研究在很大程度上是為了滿足這一需求。我們已經(jīng)利用各種遺傳標(biāo)記建立了狼的遺傳基線。我們已經(jīng)證明了遺傳上健康的狼群的組成部分，我們也證明了種群之間的遺傳交流對(duì)于防止未來的遺傳痛苦的重要性。我們已經(jīng)建立并繼續(xù)發(fā)展了近400只狼的種群血統(tǒng)，并追溯到黃石種群的創(chuàng)始狼，為了解行為和生理特征的遺傳基礎(chǔ)奠定了基礎(chǔ)。我們推進(jìn)了對(duì)狼的毛色遺傳基礎(chǔ)的理解，并探究了其在生存能力和抗病能力方面的作用。我們?cè)O(shè)計(jì)了使用狼細(xì)胞培養(yǎng)物的技術(shù)（見本卷第8章），可用于探測(cè)任何遺傳變異體的功能，這可能是未來理解適應(yīng)性的一個(gè)關(guān)鍵工具。我們第一次有了北美狼基因組的詳細(xì)圖譜，可以測(cè)量影響表型和適應(yīng)性的單個(gè)基因的突變率。我們現(xiàn)在了解了影響野生種群中基因表達(dá)和調(diào)節(jié)的基本因素，這些因素可以限制對(duì)未來環(huán)境中的壓力源的反應(yīng)。我們有計(jì)劃擴(kuò)大這項(xiàng)研究，并在解釋遺傳和表觀遺傳模式時(shí)整合疾病和行為數(shù)據(jù)。這些努力將繼續(xù)使像302M及其后代這樣的人處于基因組學(xué)研究的前沿，將我們對(duì)狼的理解，也許還有我們自己，提升到一個(gè)新的高度。

請(qǐng)?jiān)L問黃石狼網(wǎng)站（press.uchica go.edu/sites/yellowstonewolves/），觀看對(duì)丹尼爾-R-斯塔勒的采訪。

K基因座：黑狼的崛起

我想，在這些狼身上表現(xiàn)出的一些變異性可能是由于在野外與狗的雜交而造成的。

阿道夫-穆里，《麥金利山的狼》（1944）。

在黃石國(guó)家公園的狼被消滅后不久，國(guó)家公園管理局的生物學(xué)家阿道夫-穆里（Adolf Murie 1940）就去了阿拉斯加。在這里，他受國(guó)家公園管理局的委托，對(duì)現(xiàn)在的德納利國(guó)家公園和保護(hù)區(qū)內(nèi)的狼和白大角羊之間的關(guān)系進(jìn)行評(píng)估。穆里是一位開創(chuàng)性的生物學(xué)家，他的工作對(duì)終止國(guó)家公園內(nèi)的捕食者控制行動(dòng)至關(guān)重要，他實(shí)際上是一個(gè)敏銳的觀察者。作為第一個(gè)在野外研究狼的科學(xué)家，他進(jìn)行了詳細(xì)的實(shí)地觀察。在穆里的經(jīng)典著作《麥金利山的狼》中，他描述了他所觀察到的狼的毛色圖案的巨大變化。他利用這些皮毛圖案來幫助他的研究，他寫道："許多狼的顏色或圖案非常明顯，從遠(yuǎn)處就可以辨認(rèn)出來。我發(fā)現(xiàn)灰色的狼更容易識(shí)別，因?yàn)樵谒鼈冎虚g，顏色圖案的個(gè)體差異比黑狼要大"（Murie 1944, 25）。他在研究時(shí)不僅在麥金利山觀察到黑狼和灰狼的數(shù)量相當(dāng)，而且他推測(cè)這種變異的起源與該地區(qū)的狗雜交有關(guān)。

本章是關(guān)于狼的毛色變異的精彩故事。具體來說，它記錄了發(fā)現(xiàn)黑狼的起源和在野外持續(xù)存在的冒險(xiǎn)。這個(gè)故事不僅突出了黃石公園狼對(duì)科學(xué)的貢獻(xiàn)，而且還揭示了精心策劃的、長(zhǎng)期的、跨學(xué)科的科學(xué)研究有時(shí)可以帶來偶然的發(fā)現(xiàn)。從一開始，對(duì)黃石公園狼群的研究就涉及到一系列廣泛的生物課題的數(shù)據(jù)收集。雖然這種長(zhǎng)期研究有助于我們對(duì)大型食肉動(dòng)物及其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用的了解，但它也揭示了一個(gè)迷人的和意想不到的狼的遺產(chǎn)。鑒于現(xiàn)代狼學(xué)之父阿道夫-穆里對(duì)這一主題的早期思考，這個(gè)故事肯定會(huì)令他著迷。

不同顏色的狼

正如灰狼（Canis lupus)的俗名所暗示的那樣，灰色是北美和歐亞大陸最大的野生犬類的典型色調(diào)。盡管灰狼可以表現(xiàn)出從煤黑到北極白的皮毛顏色，以及兩者之間的色調(diào)變化，但它們?cè)谑澜绶秶鷥?nèi)最常見的是花紋灰。這些狼的腿部、腹部和胸部有淺色、白色的毛發(fā)，從前額到頸部、肩部和臀部有棕色和黑色的外層被毛，尾巴是黑色的，而不是單一的灰色。我們?cè)谝恍├巧砩峡吹降牧眍愵伾玢y色、灰白色的曾經(jīng)的黑狼或乳白色的個(gè)體（圖8.1），可能涉及不同顏色基因的色素控制或因衰老而產(chǎn)生的衰老模式。北美的獨(dú)特之處在于灰狼的黑色、黑化的頻率很高，在許多種群中接近50%的個(gè)體，尤其是在北美大陸的西部（Dekker 1986；Gipson等人，2002；Musiani等人，2007；Anderson等人，2009；Hedrick等人，2014）。黑狼在五大湖區(qū)各州和加拿大東部不太常見(Mech and Frenzel 1971; Mech and Paul 2008; Hedrick et al. 2014)。最極端的是北極狼（C. l. arctos）的乳白色皮毛和西南墨西哥狼（C. l. baileyi）的灰色、黑色、鐵銹色和淡黃色。在舊世界，黑狼在所有可靠的文獻(xiàn)記載中都是罕見的。從19世紀(jì)開始，可以找到零星的歷史報(bào)告，表明在西伯利亞、法國(guó)、瑞典和蘇格蘭有黑色的標(biāo)本。更早的證據(jù)來自于對(duì)中亞一個(gè)考古遺址中發(fā)現(xiàn)的狼形態(tài)的骨頭上的被毛顏色基因的古代DNA分析，時(shí)間是4000-5000年前（Ollivier等人，2013）。最近在印度（Lokhande和Bajaru 2013）和伊朗（Khosravi等人2015）也有黑狼存在的報(bào)道。撇開這些報(bào)道不談，今天舊世界的黑狼主要限制在狗和狼雜交的地區(qū)，例如在意大利（Galaverni等人，2017）。

但是，對(duì)于數(shù)十萬以黃石國(guó)家公園為中心與野生狼打交道的人來說，狼的調(diào)色板上有黑色和灰色的個(gè)體。事實(shí)上，在黃石公園，全部都是灰色個(gè)體的狼群是很罕見的。值得注意的例外是尼茲佩爾斯和天鵝湖狼群，它們的全灰色的繁殖對(duì)提供了毛色遺傳的線索，我們將很快解釋。我們首先可以把大黃石種群的創(chuàng)始者作為不同毛色的來源。在1995年和1996年之間，總共有25只灰狼和16只黑狼從加拿大和蒙大拿州西北部的來源種群中被重新引進(jìn)。并非所有這些個(gè)體都成為繁殖者，并將他們的基因傳遞下去。但我們可以跟蹤這些原始狼的后代22年的毛色變化，平均約50%為黑色，50%為灰色（圖8.2A）。這種顏色頻率的平衡甚至在狼重返黃石公園的第一個(gè)十年后就很明顯，它是一個(gè)引人入勝的演化故事的另一條線索。

顏色基因及其功能

自然界中最引人注目的多態(tài)性狀之一是動(dòng)物的顏色。多種類型的色素及其空間分布決定了動(dòng)物身體上的彩色毛發(fā)、皮膚、羽毛或鱗片的外觀（Protas和Patel 2008）。顏色的變化可以起到多種功能，包括偽裝、在物種之間或內(nèi)部發(fā)出信號(hào)，以及溫度調(diào)節(jié)（Protas和Patel 2008）。事實(shí)上，一些動(dòng)物的色素，如深色的黑色素，與生理和行為特征有關(guān)，如攻擊性、性行為或?qū)毫图膊〉姆磻?yīng)（Ducrest等人，2008）。在這種情況下，一個(gè)基于黑色素的著色基因可以影響可觀察到的特征或表型的多個(gè)不相關(guān)方面，這種現(xiàn)象被稱為多效性。因此，顏色基因的功能不是那么黑白分明的?？刂祁伾幕?qū)?dòng)物健康的影響比單純的顏色更廣泛。

哺乳動(dòng)物中幾乎所有顏色的變化都由兩種色素類型控制。黑色和棕色的色素來自產(chǎn)生尤美蘭的黑素細(xì)胞，而紅色和黃色的色素來自產(chǎn)生真黑素的黑素細(xì)胞。皮膚或毛發(fā)中的黑素細(xì)胞產(chǎn)生的真黑素和類黑素的數(shù)量和類型主要由涉及兩個(gè)基因（稱為Agouti和Mc1r）的遺傳途徑調(diào)節(jié)（Protas和Patel 2008）。然而，在各種哺乳動(dòng)物中，有許多基因可以參與著色。例如，在不同的家犬品種中看到的不同的顏色模式是由至少七個(gè)不同的基因造成的，包括Agouti和Mc1r（Schmutz和Berryere 2007）。隨著時(shí)間的推移，基因突變的積累導(dǎo)致顏色基因的不同變體，稱為等位基因，影響色素的數(shù)量和在細(xì)胞中的分布。動(dòng)物中比較常見的皮毛顏色突變之一是黑變病，在這種情況下，個(gè)體在其身體上顯示出深色的黑色素。Mc1r的突變是許多家畜和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物物種以及自然界動(dòng)物種群中公認(rèn)的黑變病的原因（Robbins等人，1993）。

然而，最近發(fā)現(xiàn)一個(gè)替代基因，稱為CBD103（或K位點(diǎn)），可導(dǎo)致家犬的黑色素沉淀（Candille等人，2007）。在狗身上，祖先的野生型CBD103等位基因允許正常的Agouti和Mc1r基因相互作用，而CBD103基因的三個(gè)核苷酸缺失會(huì)導(dǎo)致CBD103蛋白阻止Agouti功能，從而導(dǎo)致黑色毛發(fā)的顯性遺傳（Candille等人，2007；Kerns等人，2007；Anderson等人，2009）。鑒于這一發(fā)現(xiàn)，研究人員認(rèn)為要研究家犬的野生祖先，以確定類似的基因變異是否會(huì)導(dǎo)致狼的黑毛色。的確，研究人員發(fā)現(xiàn)，K基因座的一個(gè)三核苷酸缺失變體會(huì)導(dǎo)致狼的黑色毛色（Anderson等人，2009）（圖8.3A）。許多已知顏色的黃石狼被對(duì)K基因座進(jìn)行了基因分型（評(píng)估遺傳變異）以幫助這一發(fā)現(xiàn)（Anderson等人，2009）。

通過利用黃石狼血統(tǒng)的力量，從創(chuàng)始狼開始，加上個(gè)別狼的K位點(diǎn)基因型，我們能夠研究顏色的遺傳模式（Anderson等人，2009）?；仡櫸覀兲岬降娜业腟wan Lake和Nez Perce狼群只有灰色的繁殖狼。相比之下，黃石公園的大多數(shù)狼群都有黑狼和灰狼，而且繁殖對(duì)往往是由一只黑狼和一只灰狼組成，它們生產(chǎn)的窩里既有黑狼也有灰狼幼崽。黃石公園狼的K位點(diǎn)基因型告訴我們，當(dāng)狼從父母雙方獲得灰色等位基因時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)灰色表型（即，當(dāng)野生型等位基因ky純合時(shí)）。然而，黑色表型發(fā)生在狼從父母其中一方接受黑色等位基因時(shí)（KB等位基因雜合），這是常見的，或從父母雙方接受黑色等位基因時(shí)（KB等位基因純合），這是罕見的。因此，Anderson等人（2009）發(fā)現(xiàn)KB等位基因?qū)Ρ幻伾酗@性影響，這意味著雜合和純合KB等位基因的狼都有黑色被毛顏色，而純合野生型ky等位基因的狼有灰色（agouti）被毛顏色（圖8.3B）。因此，兩只野生型灰色的狼只能產(chǎn)生灰色的ky純合后代。

許多讀者可能還記得他們?cè)缙诘纳镎n，19世紀(jì)的奧地利僧侶孟德爾（Gregor Mendel）通過對(duì)豌豆植物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，概念化地證明了生物性狀的遺傳規(guī)律（Henig 2001）。狼的黑毛色的遺產(chǎn)是孟德爾遺傳模式的一個(gè)現(xiàn)代教科書的例子（見圖8.3B）。更重要的是發(fā)現(xiàn)了影響特定表型的基因變異，這在研究自然種群時(shí)是很罕見的。識(shí)別特定基因突變的研究通常使用實(shí)驗(yàn)室培育的模式物種，這使得性狀的遺傳基礎(chǔ)可以通過對(duì)后代的表型評(píng)估而被發(fā)現(xiàn)。狼是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈兊挠H戚--家犬，一直是廣泛的遺傳研究的焦點(diǎn)。因此，我們有一個(gè)關(guān)于狗的特征（如毛色）和狗的基因組所包含的遺傳信息庫(kù)，可以用來了解野生狼的表型變化。有了孟德爾或穆里等科學(xué)家所不具備的分子技術(shù)，我們也有能力透過過去的窗口，探索這種性狀變異的演化史。

黑色毛發(fā)的一個(gè)不尋常的來源

在確定了K基因座的功能及其遺傳方式后，我們又調(diào)查了黑毛色的來源。被馴化的動(dòng)物往往受益于在其野生祖先中具有優(yōu)勢(shì)的基因突變，如影響體型和壽命的白細(xì)胞介素1生長(zhǎng)因子（IGF1）基因（Gray等人，2010）。然而，遺傳數(shù)據(jù)支持狼的K基因座的情況正好相反，因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)KB等位基因產(chǎn)生于家犬，并通過雜交轉(zhuǎn)移到狼身上。狗是在15000多年前從狼馴化而來（MacHugh等人，2017），而K位點(diǎn)是家犬的基因引入野生狼的第一個(gè)證據(jù)（Anderson等人，2009）。安德森等人（2009年）使用52個(gè)SNP（單核苷酸多態(tài)性）的遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)集，對(duì)從黃石公園到育空地區(qū)以及向東的47只狼進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)K位點(diǎn)在黑狼中經(jīng)歷了非常強(qiáng)烈的正向選擇（選擇性清除）。當(dāng)一個(gè)基因突變進(jìn)入一個(gè)種群并賦予擁有該變體的個(gè)體一些優(yōu)勢(shì)時(shí)，就會(huì)發(fā)生選擇性掃蕩，該變體在種群中的頻率會(huì)迅速增加，以至于沒有足夠的時(shí)間讓該變體基因發(fā)生新的DNA突變，或讓重組打破它周圍的DNA。因此，含有該突變的基因單倍型（作為一個(gè)單位遺傳的染色體區(qū)域）被說成是?"掃蕩?"到一個(gè)高頻率，在含有該突變的單倍型上留下了低遺傳變異的特征簽名。在狼群中發(fā)現(xiàn)了這樣的特征，表明在最初從狗引進(jìn)的事件后發(fā)生了強(qiáng)烈的選擇。換句話說，該突變是通過雜交轉(zhuǎn)移到狼身上的，然后接受該突變的狼的后代比它們的同類有一些健康優(yōu)勢(shì)，并產(chǎn)生了自己的帶有該突變的后代。

有什么證據(jù)表明顏色突變是由家犬納入狼的基因庫(kù)，而不是反過來？來自染色體K位點(diǎn)區(qū)域的遺傳數(shù)據(jù)可以用來確定個(gè)體的相似性，使用的方法稱為演化樹構(gòu)建鄰接法。來自狗和狼的這些數(shù)據(jù)的鄰接樹根據(jù)分類群（狼或狗）將野生型的灰色ky單倍型分組，但將黑色KB單倍型分組，而不考慮分類群。這種模式表明，該突變有一個(gè)單一的起源，隨后通過雜交進(jìn)行傳播。為了確定雜交的方向，Anderson等人（2009）估計(jì)了KB和ky等位基因在狗和狼中的年齡；他們發(fā)現(xiàn)KB等位基因在狼中比在狗中年輕得多。這一發(fā)現(xiàn)表明，該基因的引入是由狗到狼發(fā)生的，并且該變體從雜交點(diǎn)傳播，橫掃整個(gè)北美狼種群（Schweizer等人，2018）。

黑色毛發(fā)的地理起源

自最初發(fā)現(xiàn)K基因座以來，大量的工作已經(jīng)闡明了該基因的演化歷史和生態(tài)重要性。在一項(xiàng)研究中，Schweizer等人（2018年）使用捕獲測(cè)序（一種對(duì)基因組數(shù)千個(gè)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序的方法）對(duì)黃石公園的200多只狼以及北美其他種群的狼的K基因座進(jìn)行測(cè)序。這種方法允許測(cè)量和比較不同種群之間的遺傳變異水平。根據(jù)親緣關(guān)系的遺傳措施，他們估計(jì)狼和狗之間的引入事件發(fā)生在北美西北部的某個(gè)地方。加拿大育空地區(qū)和西北地區(qū)的狼種群具有非常高的KB單倍型的遺傳多樣性，這表明這些種群可能在引入后的最長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)具有KB等位基因。耐人尋味的是，本地狗和人類在這個(gè)地區(qū)有很長(zhǎng)的共存歷史。

一些探索美國(guó)本土犬種地理起源的研究表明，北極犬種，如因紐特雪橇犬、加拿大愛斯基摩犬和格陵蘭犬，具有古老的線粒體DNA單倍型，并顯示出與狼的古老混雜證據(jù)（Brown等人，2013；van Asch等人，2013）。此外，這些種群中的狗代表了唯一具有新世界狼特有的線粒體單倍型的現(xiàn)存品系，而這些品種的黑色被毛顏色是由K基因座的突變決定的?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)最初的引入事件發(fā)生在北美的西北部地區(qū)，在那里狗和原住民首先與共享類似獵物（如馴鹿）的狼種群共存。值得注意的是，與狼的KB單倍型最接近的狗品種，拉布拉多獵犬，是在北美的高緯度地區(qū)發(fā)展起來的，可能與北美本地的狗有共同祖先，這些狗與第一批與狼成功雜交的黑狗有關(guān)（Schweizer等人，2018）。

在最初對(duì)北美狼的K位點(diǎn)進(jìn)行的研究中，估計(jì)從狗到狼的引入事件發(fā)生在大約13000年前（Anderson等人，2009）（圖8.4）。然而，該估計(jì)所使用的數(shù)據(jù)是基于在狗和狼身上的52個(gè)SNPs的基因型。廣泛的全基因組重測(cè)序提供了更高的遺傳變異分辨率，結(jié)合估計(jì)等位基因年齡的新方法，使引入事件發(fā)生的時(shí)間更晚。最古老的KB等位基因年齡值出現(xiàn)在育空狼身上，其平均值從1598年到7248年前不等，取決于所使用的突變率（Schweizer等人，2018）。最年輕的等位基因年齡出現(xiàn)在黃石狼種群中，從202年到1942年前不等；這個(gè)估計(jì)的時(shí)間反映了黃石狼創(chuàng)始狼的影響，它們的祖先可能是最近才獲得遺傳突變的。

對(duì)K基因座的選擇

在闡明了北美狼黑色素的演化史后，我們又問，為什么黑色的毛色對(duì)狼來說可能是有利的？當(dāng)K基因座周圍的遺傳模式顯示出對(duì)黑色突變的強(qiáng)烈選擇時(shí)，這個(gè)問題就很有意義了。此外，如果黑色被毛的顏色似乎受到強(qiáng)烈的選擇，那么為什么黑色和灰色被毛的顏色在一些北美種群中仍在分離？黑狼和灰狼之間的健康權(quán)衡是否能解釋這些種群中兩種顏色隨著時(shí)間的推移而保持下來？這些問題為探討遺傳學(xué)、生存能力、健康和選擇之間的聯(lián)系的研究奠定了基礎(chǔ)（例如，Coulson等人，2011；Stahler等人，2013；Hedrick等人，2014；Schweizer等人，2018）。鑒于其相對(duì)于K位點(diǎn)的遺傳學(xué)、行為學(xué)、生命史和種群學(xué)的長(zhǎng)期和詳細(xì)數(shù)據(jù)，黃石狼是這個(gè)舞臺(tái)上的明星選手。

其中第一項(xiàng)研究采用了經(jīng)典的種群遺傳學(xué)與復(fù)雜的數(shù)學(xué)建模方法相結(jié)合，將生存和繁殖成功數(shù)據(jù)與K位點(diǎn)基因型結(jié)合起來，對(duì)280只狼進(jìn)行了11年的研究（Coulson等人，2011）。從這些數(shù)據(jù)中，估計(jì)了K位點(diǎn)基因型的具體種群統(tǒng)計(jì)率和生命史參數(shù)。這些估計(jì)值可以比較KB等位基因純合和雜合的狼（均為黑色）與野生型k y等位基因純合的狼（灰色）之間與健康體質(zhì)有關(guān)的生命率（如年生存率、壽命和繁殖成功率）。這項(xiàng)研究表明，雜合的黑狼具有最高的達(dá)爾文適合度，具有最大的生存率和繁殖成功率，其次是純合的灰色個(gè)體，其可比性略低。有趣的是，KB等位基因純合的黑狼生存率和繁殖率非常低，這在一定程度上解釋了它們?cè)诜N群中的頻率低于預(yù)期。在黃石公園捕獲的狼中，只有5%的狼是黑色純合基因。相同毛色的個(gè)體之間在體能上的這種顯著差異是一個(gè)關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)。首先，它有助于否定黑色被毛顏色被選為適應(yīng)性偽裝的觀點(diǎn)--例如，它通過在更多的森林環(huán)境中掩蓋狼的身影而在捕獵中賦予某種優(yōu)勢(shì)。由于黑色的同種異體的存活率和繁殖成功率都很低，而且在調(diào)查的種群中非常罕見，因此很明顯，黑色被毛本身并沒有帶來選擇優(yōu)勢(shì)。那些熟悉狼的人認(rèn)為，狼是很少隱藏或伏擊獵物的捕食者，當(dāng)適應(yīng)性偽裝假說首次被提出時(shí)，他們已經(jīng)對(duì)其持懷疑態(tài)度（Anderson等人，2009）。

更重要的是，這些結(jié)果表明，K位點(diǎn)基因型之間不同的存活率和加入率使黑色等位基因具有雜合優(yōu)勢(shì)。雜合優(yōu)勢(shì)意味著雜合基因型比純合顯性基因型或純合隱性基因型具有更高的相對(duì)適應(yīng)性（Fisher 1922；Hedrick 2012）。一個(gè)公認(rèn)的雜合優(yōu)勢(shì)的案例是人類的等位基因，它在純合個(gè)體中引起鐮刀型細(xì)胞貧血，但卻使雜合子個(gè)體對(duì)瘧疾感染有更強(qiáng)的抵抗力，在瘧疾肆虐的地區(qū)最為常見（Hedrick 2011）?？紤]到1995年和1996年創(chuàng)始狼種群中基因型的原始分布，對(duì)預(yù)期的K位點(diǎn)等位基因頻率進(jìn)行建模的分析（Hedrick等人，2014），以及通過獨(dú)立確認(rèn)（Schweizer等人，2018），進(jìn)一步支持了狼體內(nèi)黑色等位基因的雜合優(yōu)勢(shì)。這項(xiàng)工作在一定程度上解釋了黃石種群中觀察到的黑色KB和灰色ky等位基因的頻率是由平衡多態(tài)性造成的，這種情況下，雜合子具有最高的適宜水平，導(dǎo)致兩種表型的維持。但問題仍然存在。會(huì)不會(huì)有其他因素影響種群中兩種毛色的維持？黑色等位基因的選擇優(yōu)勢(shì)又是什么？Coulson等人（2011年）和Hedrick等人（2014年）都推測(cè)，強(qiáng)烈的黑色雜合優(yōu)勢(shì)的存在，以及黑色和灰色純合在體質(zhì)上的巨大不對(duì)稱性，表明該基因的某些其他功能可能決定了體質(zhì)差異?；谶@項(xiàng)工作，我們推測(cè)K基因座可能對(duì)抗病性或其他與免疫學(xué)有關(guān)的性狀具有多效性。這是因?yàn)镵基因座除了在犬科動(dòng)物的黑色中起作用外，還是一個(gè)β-防御素基因，屬于哺乳動(dòng)物的一組基因，與抵抗某些類型的微生物病原體有關(guān)。但在我們闡述該基因的這一特性之前，另一個(gè)涉及被毛顏色的迷人發(fā)現(xiàn)使我們了解到黑狼和灰狼是如何在黃石國(guó)家公園保持相似的頻率的。

異性相吸

對(duì)于人類和所有其他動(dòng)物來說，生命是關(guān)于選擇的。對(duì)動(dòng)物來說，一個(gè)重要的決定是選擇一個(gè)能產(chǎn)生后代的配偶。因此，各種分類群中的非隨機(jī)配偶選擇模式長(zhǎng)期以來一直引起各學(xué)科科學(xué)家的興趣，包括動(dòng)物行為、物種劃分和一般的演化（Lewontin等，1968；Partridge，1983；Coyne和Orr，2004）。根據(jù)與自己的相似性（即相似的表型）選擇配偶，被稱為正選型交配，代表了自然界中個(gè)體的總體傾向（Jiang等人，2013）。可證實(shí)的動(dòng)物與表型不相似的個(gè)體交配的例子很少。然而，這種負(fù)選型交配（或異型交配）可以減少近親繁殖（Pusey和Wolf 1996），增加和維持遺傳變異（Jiang等人，2013；Hedrick等人，2016）。

多年來對(duì)黃石公園每個(gè)狼群的繁殖對(duì)的詳細(xì)了解，提供了一個(gè)獨(dú)特的研究機(jī)會(huì)。狼是否會(huì)根據(jù)毛色來選擇配偶，這種配偶選擇是否可以為黑色雜合子的頻率提供另一種解釋？為了回答這個(gè)問題，Hedrick等人（2016）使用了21年的黃石公園狼交配事件的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)不同顏色的狼之間有大量的配對(duì)（圖8.2B）。事實(shí)上，64%的配對(duì)是在灰狼和黑狼之間進(jìn)行的（N = 261，1995-2015），而且灰公狼×黑母狼和黑公狼×灰母狼的交配也同樣過多。之前的工作已經(jīng)證明，狼會(huì)選擇非其近親的配偶（vonHoldt等人，2008年），但這項(xiàng)新的分析證明了另一種形式的非隨機(jī)配偶選擇與毛色有關(guān)。令人驚訝的是，灰狼和黑狼之間的交配似乎是哺乳動(dòng)物中唯一有記載的任何性狀的負(fù)選型交配的例子，也是脊椎動(dòng)物中唯一有記載的單基因、自然發(fā)生的顏色多態(tài)性的例子（Jiang等人，2013；Hedrick等人，2016）。

這一發(fā)現(xiàn)對(duì)過去22年黃石公園黑狼和灰狼頻率穩(wěn)定的總體模式具有重要意義。盡管Coulson等人（2011）和Hedrick等人（2014）的工作表明，黑色等位基因的雜合優(yōu)勢(shì)可以解釋觀察到的平衡顏色多態(tài)性，但現(xiàn)在出現(xiàn)了一個(gè)?"異性相吸?"的案例。Hedrick等人（2016）在隨機(jī)或負(fù)選型交配的模型中使用觀察到的交配頻率，發(fā)現(xiàn)負(fù)選型交配情況下黑色KB等位基因的預(yù)測(cè)頻率與觀察到的平均值接近。這一結(jié)果意味著KB等位基因的觀察頻率，項(xiàng)比隨機(jī)交配事件，負(fù)選型交配可以更好地解釋。此外，基因型頻率的模式--即觀察到的黑色純合基因的比例和觀察到的黑色雜合子的過剩--與負(fù)選型交配相一致。重要的是，這些結(jié)果表明，負(fù)選型交配可能是維持黃石公園狼種群顏色多態(tài)性的全部原因（Hedrick等人，2016）。盡管這些發(fā)現(xiàn)有助于解釋在黃石公園觀察到的一些毛色頻率模式，但它們不一定排除雜合優(yōu)勢(shì)的作用。此外，這些發(fā)現(xiàn)都沒有為黑色KB等位基因的負(fù)選型交配或雜合優(yōu)勢(shì)的機(jī)制提供直接證據(jù)。

被毛顏色對(duì)繁殖和行為的影響

近年來，又有兩項(xiàng)發(fā)現(xiàn)將黃石狼的毛色與行為和生命史特征聯(lián)系起來。在一項(xiàng)關(guān)于雌性繁殖成功率的研究中，我們確定了決定產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔存活率的各種因素的優(yōu)勢(shì)（Stahler等人，2013）（見本卷第3章和第4章）。除了更可預(yù)測(cè)的雌性年齡和體型、群體大小、疾病和種群密度對(duì)繁殖性能的影響外，Stahler等人（2013）發(fā)現(xiàn)，灰色毛發(fā)的雌性比黑色雌性的年產(chǎn)仔存活率高25%。他們假設(shè)，繁殖和其他健康因素（如生存）之間的權(quán)衡可能解釋了黑色和灰色雌性生殖成功的這些差異。鑒于基于黑色素的著色通常與野生脊椎動(dòng)物的能量平衡、壓力和免疫力的調(diào)節(jié)作用有關(guān)（Ducrest等人，2008；Gasparini等人，2009），KB等位基因與免疫能力之間可能存在正相關(guān)，使黑色雜合狼具有生存優(yōu)勢(shì)。然而，免疫的成本可能會(huì)導(dǎo)致黑狼的能量消耗，轉(zhuǎn)移原本有利于其繁殖成功的資源（例如，通過妊娠和哺乳），這種模式已經(jīng)在其他哺乳動(dòng)物（Graham等人，2010）和鳥類（Gasparini等人，2009）中得到證實(shí)。

另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，被毛顏色在領(lǐng)地行為中起作用，在與其他狼群相遇時(shí)，黑狼的攻擊性比灰狼低。Cassidy等人（2017）在一項(xiàng)為期16年的研究中記錄了狼群間相遇時(shí)的攻擊性行為，發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩個(gè)狼群規(guī)模相同時(shí)，灰色個(gè)體比黑色個(gè)體驅(qū)趕敵對(duì)狼群的可能性高近1.5倍。這一發(fā)現(xiàn)耐人尋味，因?yàn)閷?duì)黑色動(dòng)物的其他研究發(fā)現(xiàn)，在一些物種中，深色個(gè)體比淺色個(gè)體更具攻擊性（Ducrest等人，2008）。然而，在狼群中，這種模式可能與個(gè)體對(duì)應(yīng)激情況的不同反應(yīng)有關(guān)，并且K位點(diǎn)可能對(duì)應(yīng)激的生理反應(yīng)有次要影響。Cassidy等人（2017年）比較了黑狼和灰狼的皮質(zhì)醇水平，這是一種對(duì)應(yīng)激反應(yīng)釋放的激素。他們發(fā)現(xiàn)，灰狼的皮質(zhì)醇基礎(chǔ)水平比黑狼高。同樣，黑色家犬的基礎(chǔ)皮質(zhì)醇水平（Ben-nett和Hayssen，2010年）和攻擊率（Houpt和Willis，2001年；Amat等人，2009年）也比非黑狗低。回顧一下，基于黑色素的著色基因通過對(duì)黑色皮質(zhì)素系統(tǒng)的多效作用與生理和行為特征（如免疫系統(tǒng)功能、應(yīng)激反應(yīng)）相關(guān)（Ducrest等，2008）。我們的結(jié)果表明，K位點(diǎn)可能與激素分泌有錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系，因此，可能影響攻擊性行為。此外，皮質(zhì)醇的產(chǎn)生可以削弱免疫系統(tǒng)的功能，這可能與一個(gè)功能假設(shè)有關(guān)，即灰色狼的免疫系統(tǒng)功能與黑狼不同。這給我們帶來了迄今為止對(duì)K基因座選擇機(jī)制的一個(gè)更具體的解釋：它與增加對(duì)疾病或其他免疫學(xué)相關(guān)性狀的適應(yīng)力有關(guān)。

K位點(diǎn)在免疫中的作用

自從最初發(fā)現(xiàn)K位點(diǎn)蛋白（CBD103）是β-防御素家族抗菌肽的成員（Pazgier等人，2006）后，人們猜測(cè)它可能參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)（Yang等人，1999）。防御素由幾乎所有脊椎動(dòng)物的皮膚、腎臟和氣管支氣管內(nèi)壁的上皮細(xì)胞產(chǎn)生，它們?cè)谖⑸锶肭謺r(shí)可以釋放防御素（Yang等人，1999）。這些多肽通過增加目標(biāo)膜的通透性，從而抑制微生物內(nèi)的DNA和RNA活動(dòng)，引發(fā)對(duì)細(xì)菌、病毒和真菌的抗菌反應(yīng)（Ganz 2003）。在狗身上，編碼防御素的基因在基因組中成簇出現(xiàn)，包括16號(hào)染色體上的幾個(gè)基因，K基因座就出現(xiàn)在那里。這些基因在不同的品種中出現(xiàn)不同數(shù)量的拷貝（Leonard等人，2012），盡管目前還不清楚更多的拷貝是否對(duì)應(yīng)于更高的抗菌反應(yīng)。K基因座在皮膚（Candille等人，2007年）和上呼吸道（Erles和Brownlie，2010年）中高度表達(dá)，并在對(duì)狗的呼吸道病原體--支氣管敗血波氏桿菌的反應(yīng)中顯示出抗菌活性（Erles和Brownlie，2010）。作為黑皮質(zhì)素途徑的一個(gè)確定的組成部分，K位點(diǎn)除了影響生理和行為特征外，還可能抵御病原體（Ducrest等人，2008）。

這一難題中最難以捉摸的部分是K位點(diǎn)對(duì)狼的健康影響的確鑿證據(jù)。對(duì)黃石國(guó)家公園傳染病作用的研究提供了研究表型或基因型特定的毛色與疾病之間是否存在聯(lián)系的機(jī)會(huì)。在已知影響黃石公園狼的各種傳染病中，犬瘟熱病毒（CDV）和疥癬（由寄生性疥螨引起）是值得注意的角色（Almberg等人，2009，2012）。關(guān)于疥癬，我們還沒有發(fā)現(xiàn)黑狼和灰狼之間在感染率、嚴(yán)重程度或恢復(fù)方面有明顯的差異，也沒有發(fā)現(xiàn)K位點(diǎn)基因型之間的差異。這有點(diǎn)令人驚訝，因?yàn)橐阎?防御素在皮膚上皮細(xì)胞中具有抗菌特性，而皮膚上皮細(xì)胞是螨蟲成功入侵其宿主的環(huán)境。關(guān)于CDV，一種影響狼的呼吸道、胃腸道、結(jié)膜（眼睛）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病毒病原體，我們確實(shí)發(fā)現(xiàn)了一種顏色基因型的特定模式。初步的數(shù)據(jù)分析表明，黑色雜合狼在疾病爆發(fā)年（1999年、2005年、2008年）暴露于CDV后，其年存活率可能高于灰色純合狼。盡管到目前為止，被毛顏色和疾病之間缺乏可驗(yàn)證的聯(lián)系，但我們繼續(xù)用在黃石公園收集的數(shù)據(jù)探究可測(cè)試的假說。

在本卷第七章中，我們說黃石公園的狼一直處于基因組研究的前沿?？赡軟]有比將尖端的細(xì)胞系研究應(yīng)用于K位點(diǎn)難題更好的例子了。最近，我們開發(fā)了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，使狼的成纖維細(xì)胞（下層皮膚的細(xì)胞）和角質(zhì)細(xì)胞（上層皮膚的細(xì)胞）的細(xì)胞系可以從狼捕獲期間的耳部活檢針頭中發(fā)展出來（Johnston 2016）（圖8.5）。這些細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)無限的DNA和RNA來源，并給我們提供了一個(gè)非侵入性的方法來測(cè)試特定細(xì)胞層面的挑戰(zhàn)對(duì)基因的影響。有史以來第一次為野生動(dòng)物建立了基于種群的細(xì)胞檢測(cè)。這一成功是第一個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟，使我們能夠測(cè)試灰色和黑色K位點(diǎn)基因型是否會(huì)對(duì)病原體暴露作出不同的反應(yīng)。

具體來說，這些細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)被用來評(píng)估K位點(diǎn)在表皮組織中的等位基因特異性功能，該基因在表皮組織中高度表達(dá)（Johnston 2016）。角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法建立了一個(gè)來自野生狼的角質(zhì)細(xì)胞系小組。然后，從黃石公園和愛達(dá)荷州的24只野生狼建立了細(xì)胞系，代表了14只純合野生型ky灰狼和10只雜合型KB黑狼。不幸的是，鑒于純合KB黑狼的罕見性，沒有獲得純合KB基因型的皮膚活檢。然而，這一問題通過使用最近的基因組編輯技術(shù)得到了解決，該技術(shù)正在科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域引起熱議。這種獨(dú)特的技術(shù)，稱為CRISPR/Cas9，允許科學(xué)家通過移除、添加或改變DNA序列的部分來精確編輯個(gè)體基因組的部分（Zhang等人，2014年）。CRISPR/Cas9基因編輯被用于單個(gè)野生型ky灰狼細(xì)胞系，以構(gòu)建黑KB等位基因雜合和純合的細(xì)胞系（Johnston 2016）。

為了評(píng)估每個(gè)細(xì)胞系對(duì)微生物感染的細(xì)胞反應(yīng)，我們用合成抗原以及活體CDV感染了角質(zhì)細(xì)胞。盡管角質(zhì)細(xì)胞對(duì)這些免疫挑戰(zhàn)表現(xiàn)出基因表達(dá)反應(yīng)，但它們?cè)贙位點(diǎn)基因型之間并沒有表現(xiàn)出明顯的表達(dá)差異。這一發(fā)現(xiàn)表明，K基因座對(duì)病原體暴露反應(yīng)的潛在影響不是由對(duì)角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的影響所介導(dǎo)的。然而，K基因座可能影響免疫的其他機(jī)制仍未得到驗(yàn)證。首先，在細(xì)菌或病毒與β-防御素肽的直接相互作用過程中（Wilson等人，2013年），KB等位基因可能會(huì)降低肽與細(xì)菌或病毒的結(jié)合親和力，最終導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞的可生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)菌或病毒數(shù)量減少。此外，β-防御素的抗菌活性可能只在活的、會(huì)呼吸的狼的實(shí)際皮膚、口腔或呼吸環(huán)境中體現(xiàn)出來，而不是在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)的細(xì)胞系中。最后，KB等位基因?qū)w質(zhì)的影響可能是由本研究中未評(píng)估的對(duì)病原體的反應(yīng)所介導(dǎo)。盡管最初的實(shí)驗(yàn)研究沒有發(fā)現(xiàn)KB等位基因的免疫學(xué)優(yōu)勢(shì)，但這是一個(gè)重要的科學(xué)進(jìn)步。除了測(cè)試關(guān)于K基因座的假設(shè)外，細(xì)胞系的構(gòu)建可用于探測(cè)野生環(huán)境中任何基因變體的功能，并可能成為未來研究中理解適應(yīng)性和健康性的關(guān)鍵工具。

目前，K基因座的具體選擇重點(diǎn)仍不確定。但我們知道，除了導(dǎo)致黑色素沉著外，這個(gè)基因還具有免疫功能。鑒于一個(gè)物種內(nèi)以黑色素為基礎(chǔ)的顏色變化往往與生理、行為和生命史特征的變化有關(guān)（Ducrest等，2008），通過基因型與環(huán)境的相互作用，可供選擇的顏色形態(tài)可能在不同的環(huán)境中受到青睞（Roulin 2004）。在鳥類和魚類中，不同顏色的個(gè)體對(duì)壓力、食物供應(yīng)和疾病有不同的反應(yīng)（Kittilsen等人，2009；Almasi等人，2010；Jacquin等人，2013）。在多變的氣候和環(huán)境條件下，這種反應(yīng)的變化可以促進(jìn)顏色多態(tài)性的維持（Karell等人，2011；Jacquin等人，2013）。因此，類似的過程可能發(fā)生在歷史上狼所面臨的不斷變化的環(huán)境中，增強(qiáng)了K基因座的選擇。可以想象，KB等位基因可能首先在狗身上演化并持續(xù)存在，因?yàn)樗鼘?duì)在舊世界密集的狗群中興起的疾病具有更強(qiáng)的免疫力。這可能使該位點(diǎn)預(yù)先適應(yīng)了鄰近的狼種群的選擇，這些狼種群在早期人類和狗殖民北美時(shí)也可能被基于狗的新疾病感染。與這種猜測(cè)一致，Schweizer等人（2018年）在黃石狼種群中檢測(cè)到了近期K位點(diǎn)平衡選擇的特征，該種群遭受到與生態(tài)系統(tǒng)中其他食肉動(dòng)物物種共享的復(fù)發(fā)性傳染病。這些狼可能代表了在高食肉動(dòng)物密度下對(duì)K基因座進(jìn)行自然選擇的當(dāng)代案例，這些食肉動(dòng)物密度是病原體的儲(chǔ)庫(kù)，黑色等位基因提供了更強(qiáng)的免疫力。

建立一個(gè)關(guān)于毛色選擇的綜合模型

最近，尚未發(fā)表的建模工作試圖將狼的毛色敘述的各條線聯(lián)系在一起。Sarah Cubaynes及其同事將Coulson等人（2011年）、Stahler等人（2013年）和Hedrick等人（2016年）的研究結(jié)果納入一個(gè)單一的模型，其中包括雜合子的生存優(yōu)勢(shì)、灰狼的繁殖成功優(yōu)勢(shì)和負(fù)選型交配。然后，他們用這個(gè)模型研究了如果改變黑色雜合子生存優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)度、灰色生殖成功優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)度、交配系統(tǒng)和疾病頻率會(huì)發(fā)生什么。

該模型顯示，隨著疾病爆發(fā)頻率的增加，應(yīng)該有更多的黑狼和更多的黑色等位基因的頻率。即使灰色繁殖優(yōu)勢(shì)和黑色雜合子優(yōu)勢(shì)的相對(duì)強(qiáng)度被修改到20%，也能預(yù)測(cè)到這一結(jié)果。此外，該模型預(yù)測(cè)，當(dāng)疾病爆發(fā)每六年或更長(zhǎng)時(shí)間發(fā)生一次時(shí)，那些負(fù)選型交配的狼應(yīng)該比那些正選型交配的狼有更高的健康能力。

結(jié)論

科學(xué)進(jìn)步的最大特點(diǎn)是知識(shí)的遞增。突破和創(chuàng)新也說明了具有不同專業(yè)領(lǐng)域的科學(xué)家之間的合作的價(jià)值。

具有不同專業(yè)領(lǐng)域的科學(xué)家之間的合作價(jià)值。北美黑狼的崛起、K位點(diǎn)基因的功能及其演化史的史詩故事就是這一過程的縮影。通過將我們強(qiáng)大的研究鏡頭對(duì)準(zhǔn)黃石公園的狼，我們不僅了解了黑毛色的遺產(chǎn)，而且還發(fā)現(xiàn)了其重要的種群學(xué)、行為學(xué)和生態(tài)學(xué)意義。此外，盡管它與免疫力的聯(lián)系需要進(jìn)一步解決，但在未來狼將面臨的不斷變化的環(huán)境條件下，包括疾病、氣候變化和棲息地退化，毛色可能會(huì)變得更加重要。

在這條發(fā)現(xiàn)的道路上，K基因座的故事已經(jīng)成為一個(gè)重要的科學(xué)案例。例如，它證明了在馴化過程中出現(xiàn)的變異體在野外也是可行的，并能豐富自然種群的遺傳遺產(chǎn)。換句話說，雜交可以是適應(yīng)性的。此外，我們確定毛色變異的遺傳結(jié)構(gòu)的能力，有助于我們確定自然界中遺傳變異的選擇和維持機(jī)制。這個(gè)故事揭示了社會(huì)食肉動(dòng)物在繁殖、生存、健康、攻擊和配偶選擇方面的健康影響和權(quán)衡。即使是狼的KB和ky等位基因的孟德爾遺傳模式，也為生物教育者和學(xué)生提供了一個(gè)引人入勝的課程，否則他們就會(huì)面臨思考一個(gè)由19世紀(jì)的科學(xué)家進(jìn)行的古老的豌豆植物實(shí)驗(yàn)。我們的研究還證明了將前沿技術(shù)應(yīng)用于野生動(dòng)物的可行性，如基因組捕獲陣列、種群級(jí)細(xì)胞系和先進(jìn)的基因編輯工具。最后，它強(qiáng)調(diào)了深思熟慮、以問題為導(dǎo)向的長(zhǎng)期研究的價(jià)值。

北美黑狼的遺產(chǎn)可能始于泰加林區(qū)的某個(gè)地方，當(dāng)時(shí)一只野生灰狼與一只與早期原住民隊(duì)伍中的黑狗發(fā)生了一段情緣。從這里，我們可以追溯到幾千年歷史中的基因之旅，以及黃石國(guó)家公園的狼群。對(duì)于那些關(guān)注狼研究的豐富歷史，甚至更廣泛地關(guān)注分子遺傳學(xué)和演化的人來說，K基因座的故事確實(shí)是一場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的冒險(xiǎn)。在阿道夫-穆里在黃石公園工作并北上觀察阿拉斯加的黑狼和灰狼之前，黃石公園的一位管理員對(duì)狼進(jìn)行了一次引人注目的觀察（諾里斯1881，42）。在黃石國(guó)家公園1880年的年度報(bào)告中，該公園的第二任園長(zhǎng)Philetus W. Norris寫道：

大型、兇猛的灰狼或布法羅狼，鬼鬼祟祟、咆哮的郊狼，以及一種明顯介于兩者之間的黑褐色或黑色的物種，曾經(jīng)在公園的所有區(qū)域都非常多，但它們的皮毛價(jià)值和它們很容易去撿食有馬錢子堿毒物的獸尸，幾乎導(dǎo)致它們滅絕。

直到最近，歷史學(xué)家和分類學(xué)家都可能想知道如何理解諾里斯先生在1880年的歷史引文。他將什么動(dòng)物描述為具有?“黑褐色或黑色"？現(xiàn)在我們可能知道：它們是攜帶K基因座顯性黑色等位基因的本地狼。

訪問黃石狼網(wǎng)站（press.uchica go.edu/sites/yellowstonewolves/），觀看Daniel R. Stahler的訪談

Part2未完...?

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