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? ? ? ?PBMC細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分,因此在免疫學(xué)、傳染病、惡性腫瘤、疫苗研發(fā)、移植治療、個(gè)性化醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)等領(lǐng)域作為最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)原料被廣泛使用。

一、PBMC的作用

? ? ? ?PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血單個(gè)核細(xì)胞，顧名思義，其主要細(xì)胞類(lèi)型為血液里邊具有單個(gè)核的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞)，單核細(xì)胞，吞噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞和其他少量細(xì)胞類(lèi)型。其中淋巴細(xì)胞占很大一部分。(T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞)如圖所示。

? ? ? ?這些細(xì)胞是先天免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分, 可以保護(hù)身體免受病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)的感染和異物侵?jǐn)_, 并且能夠消滅腫瘤細(xì)胞。

二、PBMC的分離原理

? ? ? ?分離PBMC的主要目的是為了將多核細(xì)胞和紅細(xì)胞去除，從而更方便地對(duì)外周血中的單核細(xì)胞進(jìn)行研究。分離單核細(xì)胞常使用Ficoll作為分離液的主要成分，它（Ficoll）是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400000，當(dāng)密度為1.2g/ml時(shí)也未超出正常生理性滲透壓，也不穿過(guò)生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分離液比重，離心后漂浮于分離液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分離液中。吸取分離液液面上的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單核細(xì)胞，并進(jìn)行之后的培養(yǎng)與檢測(cè)。

三、PBMC的培養(yǎng)

工具/原料

1）全血 （以10ml為例）

2）無(wú)菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水

3）蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)

4）RPMI 1640培養(yǎng)基 （Invitrogen）

5）胎牛血清（FBS）（GIBCO）

6）雙抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)

7）二甲亞砜（DMSO）（SIGMA）

8）預(yù)先裝好異丙醇的凍存盒

配制所需的溶液：
a. 細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 細(xì)胞凍存液：FBS中加入10%DMSO

方法/步驟

1；?將10ml全血轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加入10ml PBS溶液稀釋?zhuān)p輕混勻；

2；取兩支15ml離心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的ficoll上層，一定要輕柔，避免兩種溶液混合在一起，每只離心管各10ml稀釋血液；

3；2000rpm，20分鐘，注意，降速設(shè)置中一定要設(shè)置成no break，或者只有1-2成的制動(dòng)。離心完畢將得到如圖所示分層：

4；PBMC所在細(xì)胞層為白色。此時(shí)可以用吸管將該層細(xì)胞吸取在另一干凈的15ml離心管中。

5；加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min離心后去掉上清，再加入培養(yǎng)基進(jìn)行相同操作的清洗；

6；加入5-10ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)或者鋪板；

7；細(xì)胞凍存：將細(xì)胞離心收集之后，用細(xì)胞凍存液重懸。取1-1.5ml細(xì)胞至凍存管中，放入凍存盒（凍存盒可事先在4℃冰箱預(yù)冷）。再將凍存盒放置于-80℃冰箱過(guò)夜。第二天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期保存。

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? ? ? ?PBMC直徑約為5-8μm，人工計(jì)數(shù)難度大，且計(jì)數(shù)結(jié)果偏差大，因此，能準(zhǔn)確計(jì)數(shù)PBMC的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是實(shí)驗(yàn)人員的迫切需求。CytoEasy具有優(yōu)秀的光路系統(tǒng)和圖像識(shí)別系統(tǒng)，它不但可以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)普通細(xì)胞系，也能準(zhǔn)確計(jì)數(shù)這類(lèi)直徑很小的免疫細(xì)胞。如下圖所示：

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