轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子相互作用的研究屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究，也是研究相對(duì)集中的基因表達(dá)調(diào)控方式。轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析不能盲目地為了研究具體機(jī)制而做研究，需要與基因功能研究密切聯(lián)系起來(lái)作為前提條件。我們首先要明確感興趣的轉(zhuǎn)錄因子是否會(huì)導(dǎo)致靶基因表達(dá)水平發(fā)生改變，進(jìn)而引起細(xì)胞或動(dòng)物發(fā)生相應(yīng)的表型或生物學(xué)功能改變。當(dāng)明確這些問(wèn)題后，擬通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控去深挖其中的具體機(jī)制，通?？梢?strong>采用熒光素酶報(bào)告基因分析，包括轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子互作驗(yàn)證、確定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)結(jié)構(gòu)域。

???????熒光素酶報(bào)告基因分析可以有效地在體外評(píng)估轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控啟動(dòng)子的能力。對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子互作驗(yàn)證，目前普遍采用基于pGL3-basic載體的雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)。當(dāng)然，如果目的啟動(dòng)子活性較強(qiáng)，使用pGL3-basic即可；若啟動(dòng)子活性較弱，可以選擇帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的pGL3-enhancer或promoter載體。pGL3-basic系統(tǒng)需要用到三種質(zhì)粒（圖1）：

（1）??pGL3-basic：帶有目標(biāo)啟動(dòng)子序列的報(bào)告質(zhì)粒，螢火蟲(chóng)熒光素酶(fLuc)作為報(bào)告基因；

（2）??pRL-TK：內(nèi)參質(zhì)粒，海腎熒光素酶(rLuc)作為內(nèi)參基因，使fLuc的檢測(cè)均一化；

（3）??pcDNA3.1：轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。

圖1. pGL3-basic雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的三種質(zhì)粒圖譜

構(gòu)建好以上三種質(zhì)粒后，共同轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞。用于報(bào)告基因分析的細(xì)胞可以選擇具有轉(zhuǎn)染效率高、易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)的工具細(xì)胞，如HEK293細(xì)胞，這已得到廣泛的認(rèn)可，也是較為常見(jiàn)的做法。當(dāng)然也可以使用實(shí)驗(yàn)所用的目的細(xì)胞，或根據(jù)個(gè)人實(shí)際情況選擇常見(jiàn)、合適的細(xì)胞。

???????關(guān)于靶基因啟動(dòng)子序列，我們通常選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的區(qū)域作為啟動(dòng)子區(qū)，再運(yùn)用預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合的數(shù)據(jù)庫(kù)分析二者結(jié)合的可能性及潛在結(jié)合位點(diǎn)，常用的數(shù)據(jù)庫(kù)有JASPAR（推薦）、PROMO等。

???????那么轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子互作分析一般可以有以下幾個(gè)方面。首先可以初步明確轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因具有轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制作用；接著需要明確轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，就必須構(gòu)建啟動(dòng)子的截短體或突變體等，分別進(jìn)行驗(yàn)證雙熒光素酶驗(yàn)證分析。一般情況下，轉(zhuǎn)錄因子都具有轉(zhuǎn)錄激活/抑制結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以針對(duì)這兩個(gè)區(qū)域構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子突變體，通過(guò)比較野生型和突變型轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控能力，研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。

1、??構(gòu)建全長(zhǎng)啟動(dòng)子分析：明確轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

2、??構(gòu)建啟動(dòng)子截短體分析：將啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行缺失，構(gòu)建啟動(dòng)子截短體，與全長(zhǎng)啟動(dòng)子比較，明確缺失區(qū)域是否在轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的重要位置。

3、??構(gòu)建啟動(dòng)子點(diǎn)突變分析：通過(guò)啟動(dòng)子的截短體我們可以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用是否與潛在結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)，隨后可以進(jìn)一步對(duì)這些潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，探討結(jié)合位點(diǎn)堿基突變是否影響轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力。

4、??構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子突變體分析：另外還可以構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)功能域的突變體或截短體，研究轉(zhuǎn)錄因子的功能結(jié)構(gòu)域。

另外，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組也是比較關(guān)鍵的，只是明確轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系一般分四組，進(jìn)一步研究結(jié)合位點(diǎn)則每研究一個(gè)位點(diǎn)就增加兩組實(shí)驗(yàn)。

表1.?常規(guī)4組

表2.?常規(guī)6組（僅供參考，需根據(jù)實(shí)際情況設(shè)計(jì)）

? ?以上便是研究轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用的常用方法及一般策略，希望對(duì)大家的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有所幫助。漢恒生物在雙熒光素酶驗(yàn)證上有著成熟的服務(wù)體系，歡迎大家咨詢(xún)！