衰老代表了一系列動態(tài)的細(xì)胞狀態(tài)，包括增殖停止、氧化應(yīng)激、慢性炎癥和衰老相關(guān)的代謝表型，在血管老化中起著關(guān)鍵作用。促進(jìn)衰老的因素導(dǎo)致血管過早出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化和功能障礙，進(jìn)而發(fā)生病變，最終導(dǎo)致心血管疾病。有規(guī)律的運動可以降低心血管疾病的風(fēng)險，但其具體作用機(jī)制尚未明確。

特定組織，特別是骨骼肌、肝臟和脂肪組織釋放的代謝活性因子被認(rèn)為是運動對健康有益的基礎(chǔ)，這些因子被稱為“運動因子”。最近的研究發(fā)現(xiàn)，運動因子可以包裝在納米大小的細(xì)胞外囊泡（EVs）中，并且可以獨立于傳統(tǒng)的分泌機(jī)制釋放。含III型纖連蛋白域蛋白5（FNDC5）是一種骨骼肌富集蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域部分被切割形成一種循環(huán)的112個氨基酸，稱為鳶尾素，在運動期間對白色脂肪組織會產(chǎn)生產(chǎn)熱作用。

基于以上發(fā)現(xiàn)，同濟(jì)大學(xué)的研究團(tuán)隊在期刊《European Heart Journal》發(fā)表研究論文“Exerkine fibronectin type-III domain-containing protein 5/irisin-enriched extracellular vesicles delay vascular ageing by increasing SIRT6 stability（富含F(xiàn)NDC5/鳶尾素的EVs通過提高SIRT6的穩(wěn)定性來延緩血管老化）”，旨在探討FNDC5/鳶尾素在EVs中的表達(dá)及其生物學(xué)功能，研究FNDC5/鳶尾素在血管老化中的作用。值得一提的是，該文章使用了漢恒生物提供的AAV2/9-MHCK7-mFNDC5-EGFP和AAV2/ 9-TBG-mFNDC5-EGFP來研究富含F(xiàn)NDC5/鳶尾素的EVs的來源。

首先，作者檢測了不同條件下小鼠體內(nèi)和成肌細(xì)胞中FNDC5/鳶尾素的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與2月齡小鼠相比，24月齡老年小鼠骨骼肌和循環(huán)中FNDC5/鳶尾素蛋白水平顯著降低（圖1A和B），衰老小鼠主動脈組織中兩種促進(jìn)衰老的重要炎癥因子腫瘤壞死因子-α （TNF-α）和白介素-6 （IL-6） mRNA表達(dá)顯著升高。比較衰老成肌細(xì)胞（傳代數(shù)30）和非衰老的成肌細(xì)胞（傳代數(shù)8）的FNDC5、鳶尾素、TNF-α和IL-6的水平，與小鼠實驗呈現(xiàn)相同的結(jié)果（圖1D-F）。另外，作者使用血管緊張素II（Ang II）處理小鼠和成肌細(xì)胞促進(jìn)衰老，發(fā)現(xiàn)小鼠和成肌細(xì)胞的FNDC5/鳶尾素表達(dá)降低（圖1K-N）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)NDC5/鳶尾素在自然衰老和經(jīng)Ang II處理后表達(dá)降低。

圖1 FNDC5/鳶尾素在自然衰老和Ang II處理條件下的表達(dá)水平

接著，作者構(gòu)建了FNDC5敲除（FNDC5-KO）小鼠以探索FNDC5在血管老化中的作用。與WT小鼠相比較，發(fā)現(xiàn)FNDC5-KO小鼠壽命比WT小鼠短（圖2A）；幼齡WT與FNDC5-KO小鼠的衰老標(biāo)志物SA-β-gal染色強(qiáng)度無顯著差異，然而，老齡FNDC5-KO小鼠主動脈SA-β-gal染色強(qiáng)度大于老齡WT小鼠（圖2B）。FNDC5-KO小鼠比WT更易疲憊，在老年小鼠中尤為明顯（圖2D）。，作者發(fā)現(xiàn)抗衰老因子核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）在老齡小鼠中表達(dá)下降，在老齡FNDC5-KO小鼠中下降量更明顯（圖2F）。檢測衰老標(biāo)志物γ H2A.X和p-Chk1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)這兩種物質(zhì)在老齡小鼠主動脈中表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)NDC5-KO小鼠中這一變化更為顯著（圖2H）。因此，作者認(rèn)為FNDC5缺失加速老年小鼠主動脈血管老化。

圖2 FNDC5缺失加速老年小鼠主動脈血管老化

為進(jìn)一步研究FNDC5/鳶尾素在血管老化中的作用，作者先是使用Ang II 長期注射WT和FNDC5- KO小鼠，檢測γH2A.X、p-Chk1、TNF-α、IL-6等標(biāo)志物的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)FNDC5缺失會加重Ang II 誘導(dǎo)的血管老化，與預(yù)期相符。接著作者將WT小鼠分為兩組，一組注射Ang II，另一組注射Ang II +鳶尾素，持續(xù)4周。實驗結(jié)果顯示，注射Ang II +鳶尾素的小鼠，SA-β-gal染色強(qiáng)度降低，PWV（脈波速度）值降低，彈性蛋白含量無明顯降低，血管鈣化減少（圖3A-D），鳶尾素還抑制了γ - H2A.X、p16INK4A和促炎因子（TNF-α、Il-1α和IL-6）的表達(dá)（圖3E-H）。作者利用小鼠血管平滑肌細(xì)胞系進(jìn)行了體外實驗，也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果（圖3I-M）。以上結(jié)果表明鳶尾素可以減輕Ang II誘導(dǎo)的血管老化。

圖3 鳶尾素可以減輕Ang II誘導(dǎo)的血管老化

作者比較了靜坐或運動的WT和FNDC5-KO小鼠在注射Ang II后血管的老化情況，發(fā)現(xiàn)運動顯著減輕了Ang II誘導(dǎo)的WT小鼠衰老，但在FNDC5-KO小鼠中沒有，作者推測富含F(xiàn)NDC5/鳶尾素的Evs加強(qiáng)了運動對血管老化的抑制作用。通過電鏡觀察和免疫印跡實驗，作者發(fā)現(xiàn)FNDC5/鳶尾素在血液EVs中的形式與骨骼肌相同，而在肝臟和脂肪組織中則不同。因此作者構(gòu)建了AAV2/9-MHCK7-mFNDC5-EGFP和AAV2/9-TBG-mFNDC5-EGFP兩種病毒載體注射Ang II處理的小鼠，分別靶向骨骼肌和肝臟，，來確定哪個器官分泌的富含F(xiàn)NDC5/鳶尾素的EVs起延緩血管老化的作用。

作者觀察到相較注射了AAV2/9-TBG-mFNDC5-EGFP和對照病毒（AAV2/9-MHCK7-null，AAV2/9-TBG-null）的小鼠，注射了AAV2/9-MHCK7-mFNDC5-EGFP的小鼠主動脈SA-β-gal染色強(qiáng)度減弱，γ - H2A.X、p16INK4A和促炎因子（TNF-α、Il-1α和IL-6）表達(dá)量下降，彈性蛋白含量較高，SBP（收縮壓）和PWV下降（圖4A-G）。提取小鼠的血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs），結(jié)果顯示，只有在注射了AAV2/9-MHCK7-mFNDC5-EGFP的小鼠EVs中檢測到了FNDC5/鳶尾素（圖4 H）。另外作者發(fā)現(xiàn)，含有FNDC5/鳶尾素的EVs恢復(fù)了VSMCs的DNA復(fù)制，抑制了TNF-α和IL-6的表達(dá)，并增加了彈性蛋白的mRNA水平（圖4J-K）。這些結(jié)果表明只有注射了AAV2/9-MHCK7-mFNDC5-EGFP小鼠的EVs能抑制VSMCs的衰老。綜合體內(nèi)實驗和體外實驗的結(jié)果，作者得出骨骼肌來源的富含F(xiàn)NDC5/鳶尾素的EVs有助于延緩血管老化。

圖4 骨骼肌來源的富含F(xiàn)NDC5/鳶尾素的EVs延緩血管老化

為了進(jìn)一步闡明FNDC5/鳶尾素延緩血管老化的分子機(jī)制，作者檢測了VSMCs中3種主要長壽基因（SIRT1，SIRT3和SIRT6），發(fā)現(xiàn)經(jīng)鳶尾素處理后，SIRT6表達(dá)顯著上調(diào)（圖5A）。從運動的WT小鼠血液中提取的EVs中SIRT6表達(dá)上調(diào)，從靜止的WT小鼠和靜止或運動的FNDC5-KO小鼠中提取的EVs中SIRT6則蛋白表達(dá)無明顯變化（圖5B）。為了解FNDC5/鳶尾素如何促進(jìn)SIRT6的表達(dá)，作者對經(jīng)Ang II或Ang II +鳶尾素處理的VSMCs進(jìn)行了RNA測序（圖5C），結(jié)合RNA-Seq和qPCR分析結(jié)果，選擇了幾個具有潛在衰老相關(guān)功能的基因進(jìn)行研究，包括mt-Co3、Gcat、Dnajb3、Ptpn7、SVIP和Serpina3n，并使用sirna介導(dǎo)的敲低來研究鳶尾素抗衰老作用的真正參與因子。

作者觀察到，只有DnaJb3的缺失部分抑制了鳶尾素對Ang II誘導(dǎo)的VSMCs衰老的保護(hù)作用（圖6），因此推斷DnaJb3可能是FNDC5/鳶尾素抗衰老作用的關(guān)鍵介質(zhì)。相反，VSMCs中DnaJb3的過表達(dá)與鳶尾素上調(diào)SIRT6的表達(dá)一致(圖5F)，提示SIRT6可能位于DnaJb3的下游。

DnaJ蛋白，也稱為Hsp40，是一種通過與Hsp70協(xié)同作用參與蛋白復(fù)合物形成的共伴侶蛋白. MG132，一種泛素-蛋白酶體途徑抑制劑，也增加了SIRT6蛋白(圖5F)，表明泛素化介導(dǎo)了SIRT6降解。這些結(jié)果表明，伴侶系統(tǒng)可能參與SIRT6蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控。DnaJb3過表達(dá)顯著提高了SIRT6蛋白的半衰期（圖5G），鳶尾素也有類似的效果（圖5H）。DnaJb3過表達(dá)（圖5I）和鳶尾素處理（圖5J）均顯著降低SIRT6泛素化。

因此，作者進(jìn)一步研究了DnaJb3/Hsp40是否可以作為伴侶蛋白直接與SIRT6相互作用。共免疫沉淀分析顯示，DnaJb3確實與SIRT6相互作用（圖5K）。VER-155008（Hsp70拮抗劑）可抑制DnaJb3和SIRT6之間的相互作用（圖5L）。缺乏SIRT6的情況下，添加鳶尾素和來自運動小鼠的EVs均不能延緩VSMCs的衰老（圖5M），證實了SIRT6在鳶尾素抗衰老作用中的重要作用。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)NDC5/鳶尾素可能是通過一個涉及Hsp70的機(jī)制來激活DnaJ/Hsp40伴侶系統(tǒng)從而穩(wěn)定VSMCs中的SIRT6蛋白，最終起到延緩衰老的作用。

圖5 FNDC5/鳶尾素激活DnaJ/Hsp40伴侶系統(tǒng)穩(wěn)定SIRT6

圖6 衰老相關(guān)功能的基因敲低實驗

作者觀察到與45歲的人相比，70歲的人骨骼肌組織中的FNDC5蛋白水平降低了約50%（圖7A），血漿中鳶尾素濃度隨年齡的增長而下降（圖7B）。這表明，肌肉和血漿中與運動相關(guān)的FNDC5/鳶尾素隨著年齡的增長而減少。此外，血漿鳶尾素濃度與每周運動時間呈正相關(guān)（圖7C），與動脈僵硬指數(shù)[包括PWV、AIX（增強(qiáng)指數(shù)）和PPA（脈壓放大）]負(fù)相關(guān)（圖7D-F）。采用全模型多元線性回歸進(jìn)一步檢驗血漿鳶尾素水平與年齡、性別、體重指數(shù)、運動時間、吸煙、酒精、收縮壓、糖尿病和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等常規(guī)心血管危險因素之間的關(guān)系，結(jié)果顯示血漿鳶尾素水平與年齡、運動時間和LDL-C顯著相關(guān)（見表1）。以上研究結(jié)果表明，血漿FNDC5/鳶尾素水平與人類血管老化負(fù)相關(guān)。

圖7 血漿中鳶尾素濃度的降低與人類血管老化有關(guān)

表1 血漿鳶尾素水平與常規(guī)心血管危險因素的關(guān)系

綜上，作者闡明了運動延緩心血管老化的機(jī)制，富含F(xiàn)NDC5/鳶尾素的EVs通過激活DNAJ/Hsp40伴侶系統(tǒng)來穩(wěn)定VSMCs中的SIRT6蛋白，從而介導(dǎo)運動對血管老化的延緩作用。這一結(jié)論強(qiáng)調(diào)了代謝、運動和衰老之間的相互作用，并為解決人類自然衰老過程中久坐的生活方式引起的血管疾病提供了潛在的藥物治療方案。