寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院在2016年3月7日發(fā)表于Nature Communications（IF：12.117，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Zizhang Zhou教授，研究表明Usp7通過(guò)去泛素化轉(zhuǎn)錄輔助因子Yorkie調(diào)控Hippo途徑。

研究背景

????????Hippo途徑在器官發(fā)育和成人組織平衡中起著重要作用，它的失調(diào)已被牽涉到許多癌癥中。Hippo信號(hào)傳導(dǎo)依賴于一個(gè)核心激酶級(jí)聯(lián)，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄輔助因子Yorkie（Yki）的磷酸化。盡管Yki是Hippo途徑的關(guān)鍵效應(yīng)物，但其蛋白穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)仍不清楚。

摘要部分

????????在這里，作者表明Hippo途徑減弱了泛素特異性蛋白酶Usp7與Yki的結(jié)合，Usp7通過(guò)去泛素化Yki來(lái)調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)傳導(dǎo)。此外，Usp7的哺乳動(dòng)物同源物HAUSP在通過(guò)調(diào)節(jié)Yap泛素化和降解來(lái)調(diào)節(jié)Hippo途徑方面發(fā)揮了保守的作用。最后，作者發(fā)現(xiàn)HAUSP的表達(dá)與Yap的表達(dá)呈正相關(guān)，兩者在臨床肝細(xì)胞癌（HCC）標(biāo)本中都顯示出上調(diào)的水平?？傊?，作者的發(fā)現(xiàn)表明Yki/Yap被Usp7/HAUSP穩(wěn)定，并提供HAUSP作為HCC的潛在治療目標(biāo)。

研究?jī)?nèi)容

1.Usp7促進(jìn)Hpo目標(biāo)基因的表達(dá)? ? ?

????????為了探索調(diào)節(jié)Hpo-Yki途徑的DUB，作者進(jìn)行了RNA干擾（RNAi）介導(dǎo)的篩選。作者發(fā)現(xiàn)usp7在翼成蟲(chóng)盤和眼成蟲(chóng)盤中均勻表達(dá)，且Usp7蛋白主要定位在細(xì)胞核中。為了研究Usp7是否調(diào)節(jié)Hpo途徑，作者在翼成蟲(chóng)盤中沉默了usp7，并檢查了Hpo途徑靶基因的表達(dá)。敲除usp7顯然降低了diap1-lacZ的表達(dá)。此外，作者還檢查了其他靶基因。與對(duì)照組相比，usp7的敲除削弱了CycE和ban-lacZ的表達(dá)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，Usp7參與了Hpo-Yki信號(hào)的調(diào)節(jié)。? ? ?

????????為了避免RNAi的脫靶效應(yīng)，作者使用usp7的空等位基因usp7KG06814進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。usp7KG06814克隆，以綠色熒光蛋白（GFP）信號(hào)消失為標(biāo)志，在翼成蟲(chóng)盤中顯示出果蠅細(xì)胞凋亡抑制因子1（DIAP1）和ban-lacZ染色的減少。作者還發(fā)現(xiàn)，在眼成蟲(chóng)盤的usp7KG06814克隆中，CycE蛋白減少。此外，usp7的異位過(guò)量表達(dá)大大增加了diap1-lacZ、CycE和ban-lacZ的水平。

????????有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)usp7KG06814突變體克隆的面積比相鄰的雙胞胎斑點(diǎn)小，表明usp7的丟失可能阻礙了組織的生長(zhǎng)。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，作者產(chǎn)生了一些大的usp7KG06814克隆，并分析了克隆/孿生斑的面積比。與對(duì)照組克隆相比，usp7KG06814克隆在翼成蟲(chóng)盤和眼成蟲(chóng)盤中都表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)缺陷。

研究結(jié)論：Usp7是Hpo-Yki信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)構(gòu)成性的調(diào)節(jié)器。

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2.Usp7作用于Wts的下游，Yki的上游

????????Hpo途徑被定義為一個(gè)激酶級(jí)聯(lián)，Hpo磷酸化并激活Wts，反過(guò)來(lái)，Wts磷酸化并滅活轉(zhuǎn)錄輔助因子Yki以抑制靶基因表達(dá)。作者接下來(lái)想探究Usp7是否與Hpo信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)系。敲除Hpo增加了CycE蛋白水平，這被usp7 RNAi所逆轉(zhuǎn)，表明Usp7位于Hpo的下游，控制Hpo途徑。與Hpo類似，由wts RNAi引起的CycE和diap1-lacZ的升高被usp7敲除所抑制。由于Usp7在Hpo和Wts的下游調(diào)節(jié)Hpo信號(hào)，所以作者進(jìn)一步測(cè)試Yki和Usp7之間的關(guān)系。敲除Yki后，diap1-lacZ的表達(dá)量減少，而usp7的過(guò)表達(dá)未能使其恢復(fù)。另一方面，由yki過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的CycE的上調(diào)不能通過(guò)沉默usp7而得到緩解。同時(shí)，敲除usp7會(huì)減少Yki蛋白。不僅如此，usp7的丟失也下調(diào)了Yki的水平，但不影響Yki的轉(zhuǎn)錄。

研究結(jié)論：Usp7在Hpo和Wts的下游、Yki的上游調(diào)節(jié)Hpo途徑。

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3.Usp7與Yki相互作用??? ?

????????鑒于去泛素化酶總是通過(guò)結(jié)合和去泛素化底物來(lái)發(fā)揮其作用，作者推測(cè)與Hpo途徑的一個(gè)組成部分的相互作用對(duì)Usp7控制Hpo信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要。為了測(cè)試這種可能性，作者在S2細(xì)胞中進(jìn)行了共同免疫沉淀（co-IP）實(shí)驗(yàn)。與上述表觀分析一致，作者發(fā)現(xiàn)Usp7與Yki相互結(jié)合，但不與其他Hpo途徑成分結(jié)合，表明Usp7可能通過(guò)直接靶向Yki調(diào)節(jié)Hpo途徑。Hpo途徑中的大多數(shù)調(diào)節(jié)事件是由WW域-PPxY相互作用介導(dǎo)的，在Usp7蛋白中的搜索發(fā)現(xiàn)了一個(gè)PPxY降解子（121PPV124Y）正好位于MATH結(jié)構(gòu)域中。為了測(cè)試Yki是否通過(guò)WWdomain-PPVY相互作用與Usp7結(jié)合，作者產(chǎn)生了Usp7-ΔMATH截?cái)嗟臉?gòu)建體，并進(jìn)行了聯(lián)合IP實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Usp7和Usp7-ΔMATH都能拉低Myc-Yki，表明Usp7是以獨(dú)立于MATH的方式結(jié)合Yki。

????????另一方面，作者通過(guò)co-IP和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）下拉實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Yki的N端而不是C端負(fù)責(zé)其與Usp7的相互作用。為了確定Usp7的哪個(gè)區(qū)域負(fù)責(zé)Yki的相互作用，作者產(chǎn)生了各種Usp7截短的突變體。共同IP的結(jié)果顯示，Usp7通過(guò)其C-末端的片段與Yki-N結(jié)合。作者接下來(lái)測(cè)試了Hpo信號(hào)傳導(dǎo)是否影響Usp7-Yki的相互作用。野生型Hpo極大地阻斷了Usp7-Yki的結(jié)合，而Hpo的激酶死亡形式（Hpo-KD）則發(fā)揮了相反的作用。

研究結(jié)論：Usp7通過(guò)MATH結(jié)構(gòu)域和WW結(jié)構(gòu)域的獨(dú)立方式與Yki結(jié)合。Hpo途徑可能通過(guò)減弱Usp7-Yki的結(jié)合來(lái)減少Yki蛋白。

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4.去泛素酶的活性對(duì)Usp7調(diào)節(jié)Hpo途徑至關(guān)重要

????????為了研究Usp7去泛素酶活性對(duì)其調(diào)節(jié)Hpo途徑的重要性，作者產(chǎn)生了一個(gè)Usp7的去泛素酶缺陷突變體，其Cys250被Ala取代（usp7-CA）。聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果顯示，Usp7的這一突變并不影響其與Yki的相互作用。usp7-CA的過(guò)量表達(dá)降低了diap1-lacZ、banlacZ和CycE的表達(dá)，表明Usp7-CA可能起到了顯性負(fù)作用。此外，回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示，usp7-CA未能恢復(fù)usp7敲除引起的ban-lacZ的減少。然而，usp7-ΔMATH可以回補(bǔ)usp7敲除下的ban-lacZ水平。由于Hpo途徑的活性與眼睛的大小密切相關(guān)，作者轉(zhuǎn)向檢查Usp7是否在Hpo激活的背景下調(diào)節(jié)眼睛的大小。與對(duì)照組眼（GMRgal4>UAS-wts）相比，敲除usp7或過(guò)表達(dá)usp7-CA導(dǎo)致眼球變小，而usp7或usp7-ΔMATH過(guò)表達(dá)則增加了眼球大小。

研究結(jié)論：Usp7以脫泛素酶依賴的方式調(diào)節(jié)Hpo途徑的活性。

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5.Usp7對(duì)Yki進(jìn)行去泛素化

????????目前，對(duì)Yki蛋白的穩(wěn)態(tài)調(diào)控了解不多。為了解決這個(gè)問(wèn)題，作者在S2細(xì)胞中進(jìn)行了脈沖追逐實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)外源Myc-Yki蛋白和內(nèi)源Yki蛋白都不穩(wěn)定，主要是由于溶酶體介導(dǎo)的蛋白周轉(zhuǎn)，因?yàn)槿苊阁w抑制劑NH4Cl有效地阻止了Yki蛋白的降解。作者分離了細(xì)胞質(zhì)和核蛋白，并測(cè)試了Yki蛋白的降解情況。有趣的是，細(xì)胞質(zhì)Yki通過(guò)溶酶體被破壞穩(wěn)定，而核Yki則通過(guò)蛋白酶體降解。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，作者在Yki的C端融合了一個(gè)核定位序列（NLS），生成了Myc-Yki-NLS變體，該變體主要定位在細(xì)胞核中，并發(fā)現(xiàn)它主要通過(guò)蛋白酶體來(lái)破壞穩(wěn)定。另一方面，作者還通過(guò)在Yki的N端添加一個(gè)肉豆蔻化信號(hào)，生成了一個(gè)膜拴住的Yki形式（Myc- Myr-Yki），它專門定位在細(xì)胞質(zhì)中，并且發(fā)現(xiàn)它被溶酶體降解。這些結(jié)果表明，細(xì)胞質(zhì)的Yki蛋白經(jīng)歷溶酶體的周轉(zhuǎn)，而核Yki主要經(jīng)歷蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白分解。? ? ?

????????Usp7特異性地與Yki結(jié)合，其去泛素酶活性是Usp7調(diào)節(jié)Hpo途徑所不可缺少的，這意味著Usp7可能是維持Yki蛋白穩(wěn)定性的必要條件。與此相一致，Usp7確實(shí)阻止了Yki和Yki-NLS的降解。相反，敲除usp7會(huì)加速Yki的降解。另一方面，Usp7以去泛素酶活性依賴的方式增加了核Yki的豐度，而對(duì)細(xì)胞質(zhì)Yki蛋白沒(méi)有明顯影響。

????????作者接下來(lái)試圖用一種基于細(xì)胞的泛素化試驗(yàn)來(lái)確定Usp7是否能使Yki去泛素化。作者發(fā)現(xiàn)，敲除usp7會(huì)增加Yki的泛素化。相反，Usp7和Usp7-ΔMATH都減少了Yki的泛素化，而Usp7-CA促進(jìn)了Yki的泛素化。由于Usp7主要定位在細(xì)胞核中，它很可能使核Yki去泛素化。作者將細(xì)胞質(zhì)和核蛋白分開(kāi)進(jìn)行泛素化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Usp7對(duì)核Yki進(jìn)行了強(qiáng)有力的泛素化，而對(duì)細(xì)胞質(zhì)Yki則沒(méi)有。

研究結(jié)論：核Yki蛋白經(jīng)歷了泛素化介導(dǎo)的周轉(zhuǎn)，這被Usp7所拮抗。

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6.哺乳動(dòng)物的Usp7在功能上是保守的

????????已經(jīng)證明，Yki的哺乳動(dòng)物直系親屬Yap經(jīng)歷了β-transducin重復(fù)蛋白（β-TrCP）介導(dǎo)的泛素化和蛋白酶體依賴的蛋白分解。為了測(cè)試Usp7對(duì)Yki的調(diào)控是否在功能上是保守的，作者將人類中usp7的近似物hausp克隆到UAS-Fg骨架載體上，生成UAS-Fg-hausp轉(zhuǎn)基因蒼蠅。共同IP試驗(yàn)顯示人HAUSP可以拉低果蠅Yki。通過(guò)En-gal4對(duì)hausp的過(guò)量表達(dá)可以上調(diào)ban-lacZ和diap1-lacZ的水平，這意味著HAUSP也是Yki靶基因的一個(gè)正向調(diào)節(jié)因子。? ? ?

????????作者接下來(lái)確定HAUSP是否在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中調(diào)控Yap的穩(wěn)定性和Hpo通路的活性。共同IP結(jié)果顯示，外源Myc-Yap與293T細(xì)胞中的外源Fg-HAUSP相互作用。此外，在293T細(xì)胞中，內(nèi)源性Yap可以拉低內(nèi)源性HAUSP，反之亦然。此外，作者發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是敲除還是過(guò)度表達(dá)已知的HAUSP靶基因（p53、gli1、gli2、gli3和N-Myc），都沒(méi)有對(duì)Yap蛋白水平產(chǎn)生任何可察覺(jué)的影響，排除了HAUSP通過(guò)這些轉(zhuǎn)錄因子間接穩(wěn)定Yap的可能性。

????????與以前的研究一致，β-TrCP確實(shí)以劑量依賴的方式降解Yap，這被HAUSP阻斷，但不被HAUSP-CA（一種去泛素酶缺陷形式）阻斷。作者接下來(lái)試圖測(cè)試HAUSP是否在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)Yap進(jìn)行去泛素化。正如預(yù)期的那樣，HAUSP確實(shí)降低了Yap泛素化水平，而HAUSP-CA則發(fā)揮了相反的作用。此外，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HAUSP以一種依賴去泛素酶的方式阻止了β-TrCP介導(dǎo)的Yap泛素化。HAUSP拮抗Yap泛素化和降解的能力意味著HAUSP可能影響Hpo途徑的活性。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者進(jìn)行了實(shí)時(shí)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲除hausp后，Yap的靶基因，包括AREG、CTGF和Cyr61的表達(dá)減少，而hausp的過(guò)表達(dá)則升高。hausp的敲除和過(guò)表達(dá)都不影響yap mRNA水平，支持HAUSP通過(guò)穩(wěn)定Yap蛋白來(lái)調(diào)節(jié)Yap。

研究結(jié)論：Usp7對(duì)Yki的調(diào)控在功能上是保守的。

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7.哺乳動(dòng)物的Usp7在功能上是保守的

????????作者的上述研究已經(jīng)證明Usp7/HAUSP在果蠅和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中調(diào)節(jié)Yki/Yap的穩(wěn)定性和Hpo途徑的輸出。為了測(cè)試HAUSP是否有助于腫瘤的發(fā)生，作者選擇了干細(xì)胞癌（HCC）標(biāo)本，因?yàn)楦闻K對(duì)Hpo信號(hào)的變化特別敏感。作者評(píng)估了60對(duì)匹配的肝臟組織樣本的HAUSP蛋白水平。與以前的研究結(jié)果一致，與相應(yīng)的正常肝臟相比，60個(gè)HCC腫瘤中的49個(gè)HAUSP呈上調(diào)狀態(tài)。作者進(jìn)一步檢查了這些樣本中Yap的水平，發(fā)現(xiàn)HCC樣本中Yap的水平（60個(gè)中的51個(gè)）高于匹配的非腫瘤組織。此外，發(fā)現(xiàn)HAUSP和Yap在蛋白水平上有很強(qiáng)的正相關(guān)。一致的是，RT-qPCR結(jié)果顯示，Yap靶基因的表達(dá)在HCC樣本中確實(shí)升高了。? ? ?

????????為了探索HAUSP是否參與調(diào)控Hpo途徑和HCC的腫瘤發(fā)生，作者采用了HCC細(xì)胞系Huh7。轉(zhuǎn)染HAUSP顯然增加了Yap靶基因的mRNA水平，而HAUSP-CA沒(méi)有這種作用。一方面，hausp的敲除抑制了Yap靶基因的表達(dá)。另一方面，HAUSP的轉(zhuǎn)染促進(jìn)了Huh7細(xì)胞的增殖，而HAUSP-CA沒(méi)有顯示出任何影響。HAUSP的基因敲除阻礙了Huh7細(xì)胞的增殖，而Yap的過(guò)表達(dá)又使其恢復(fù)，這表明HAUSP通過(guò)Yap促進(jìn)了Huh7細(xì)胞的增殖。? ? ? ?

????????P5091引發(fā)了多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的凋亡，并通過(guò)抑制HAUSP的活性克服了硼替佐米的耐藥性。作者接下來(lái)想測(cè)試該抑制劑是否能調(diào)節(jié)Yap蛋白的豐度，然后調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)P5091以濃度依賴的方式減少Yap蛋白，但不影響HAUSP蛋白。一致的是，P5091處理也下調(diào)了Yap目標(biāo)的蛋白水平，包括AREG和Cyr61。此外，作者進(jìn)行了MTT實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)P5091以劑量依賴的方式減弱了Huh7細(xì)胞的增殖。作者還選擇了其他特異性的Usp7抑制劑（Usp7-IN- 155和HBX-1981856）來(lái)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與P5091類似，Usp7-IN-1和HBX-19818以劑量依賴的方式減少Yap蛋白，而不影響HAUSP水平。這些抑制劑都可以緩解HAUSP對(duì)Yap的去泛素化作用。

研究結(jié)論：作者的結(jié)果顯示，HAUSP通過(guò)穩(wěn)定Yap來(lái)積極調(diào)節(jié)HCC的腫瘤發(fā)生，為HCC的臨床治療提供了HAUSP抑制劑這一潛在藥物。

????????在這項(xiàng)研究中，作者證明了去泛素化酶Usp7通過(guò)去泛素化Yki來(lái)積極調(diào)節(jié)Yki靶基因的表達(dá)。作者提供了Usp7與Yki結(jié)合的生化證據(jù)，它被Hpo或Wts所抑制。這些結(jié)果表明，Hpo信號(hào)不僅阻止了Yki的核積累，而且還通過(guò)削弱Yki-Usp7的相互作用促進(jìn)了Yki的核降解。此外，哺乳動(dòng)物的同源物HAUSP在控制Hpo通路轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了保守的作用。最后，作者發(fā)現(xiàn)，臨床HCC樣本顯示HAUSP蛋白和Yap蛋白增加，hausp-siRNA或HAUSP抑制劑治療阻礙了HCC細(xì)胞系的增殖。因此，作者的研究結(jié)果揭示了一個(gè)保守的機(jī)制，即DUB穩(wěn)定Yki以實(shí)現(xiàn)最佳的Hpo途徑輸出，并提供HAUSP作為Hpo相關(guān)癌癥治療的潛在藥物靶點(diǎn)。

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結(jié)論與討論

????????在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)usp7在果蠅的不同發(fā)育階段以Hpo途徑獨(dú)立的方式穩(wěn)定表達(dá)，這表明Usp7可能是Yki的組成型調(diào)節(jié)因子，沒(méi)有上下文特異性。作者的數(shù)據(jù)認(rèn)為， Yki蛋白的體內(nèi)平衡受Hpo途徑活性支配。當(dāng)Hpo信號(hào)關(guān)閉時(shí)，Usp7使核Yki穩(wěn)定下來(lái)以打開(kāi)靶基因的表達(dá)。一旦Hpo通路被激活，它不僅通過(guò)磷酸化Yki抑制Yki核易位,而且通過(guò)減弱Usp7-Yki親和力而降低核Yki蛋白。因此, Hpo途徑可能通過(guò)雙重機(jī)制削弱了Yki的功能。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-08334-7