寫在前面

????????今天推薦的是由美國(guó)西北大學(xué) Feinberg 醫(yī)學(xué)院在2020年2月5日發(fā)表于Neuron（IF：17.173，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Peter Penzes教授，研究表明Usp9X在樹突樹突棘發(fā)育過程中控制ankyrin重復(fù)域蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。

研究背景

????????編碼ankyrin-G（Ankyrin-G）的 ANK3 基因變異與神經(jīng)發(fā)育障礙有關(guān)，包括智力障礙、自閉癥、精神分裂癥和雙相情感障礙。Ankyrin-G在多個(gè)神經(jīng)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括突觸發(fā)生、突觸可塑性、動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳遞以及離子通道調(diào)節(jié)。然而，突觸處ankyrin-G的上游調(diào)節(jié)劑尚不清楚。

摘要部分

????????在這里，作者展示了ankyrin-G與Usp9X（一種去泛素化酶 (DUB)）相互作用。Usp9X磷酸化增強(qiáng)了它們的相互作用，減少了ankyrin-G多聚泛素化，并穩(wěn)定了ankyrin-G以維持樹突棘發(fā)育。在前腦特異性Usp9X基因敲除小鼠 (Usp9X–/Y) 中，ankyrin-G以及包含多個(gè)ankyrin重復(fù)結(jié)構(gòu)域 (ANKRD) 的蛋白質(zhì)在出生后2周時(shí)暫時(shí)減少，但在出生后12周時(shí)恢復(fù)。然而，敲除后皮質(zhì)棘密度的降低會(huì)持續(xù)到成年期。Usp9X–/Y小鼠表現(xiàn)出ankyrin-G泛素化和聚集以及活動(dòng)過度的增加。智力障礙和自閉癥患者的Usp9X突變會(huì)消除其催化活性或ankyrin-G相互作用。作者的數(shù)據(jù)揭示了ANKRD蛋白穩(wěn)態(tài)的 DUB 依賴性機(jī)制，其損傷僅暫時(shí)影響ANKRD蛋白水平，但會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的神經(jīng)元、行為和臨床異常。

研究?jī)?nèi)容

1.Ankyrin-G穩(wěn)定性受泛素化調(diào)控，其ANKRD與Usp9X相互作用? ? ?

????????為了鑒定ankyrin-G的調(diào)節(jié)因子，作者使用其ankyrin重復(fù)序列作為誘餌進(jìn)行 了酵母 2-雜交篩選。作者鑒定了Usp9X DUB 的肽酶結(jié)構(gòu)域 (aa1719–1842)，由Usp9X編碼。作者通過小鼠皮層的共免疫沉淀證實(shí)了它們?cè)隗w內(nèi)的相互作用，并將ankyrin-G的ANKRD和調(diào)節(jié)域映射為與Usp9X的肽酶域的相互作用位點(diǎn)。Ankyrin-G 包含七個(gè)D box。將ankyrin-G的ANKRD穿入ankyrin-B 結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)保守的賴氨酸暴露在溶劑中，進(jìn)一步支持它們可用于泛素化。事實(shí)上，用蛋白酶體抑制劑 MG132 處理培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元導(dǎo)致ankyrin-G水平增加，表明ankyrin-G被蛋白酶體降解。因?yàn)锳NKRD是高度多泛素化的，作者進(jìn)一步關(guān)注這個(gè)域。

????????ANKRD中一個(gè)或兩個(gè) D box或賴氨酸的突變減弱了MG132對(duì)HEK293T細(xì)胞中ANKRD多泛素化的影響。作者在蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮存在下通過延時(shí)成像比較了野生型 (WT) GFP-ankyrin-G1-807 與其D box突變版本的神經(jīng)元的降解動(dòng)力學(xué)。D 盒突變體表現(xiàn)出比 WT GFP-ankyrin-G1-807 更慢的降解，表明ankyrin-G穩(wěn)定性受其ANKRD的Cdc20/APC依賴性泛素化調(diào)節(jié)。

研究結(jié)論：Ankyrin-G穩(wěn)定性受泛素化調(diào)控，其ANKRD與Usp9X相互作用。

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2.超分辨率成像揭示了Ankyrin-G和Usp9X空間組織和樹突棘結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系? ? ?

????????Usp9X與體細(xì)胞樹突隔室中的ankyrin-G高度共定位。作者采用結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡 (SIM) 來分析ankyrin-G和Usp9X的精確空間組織。觀察發(fā)現(xiàn)，多個(gè)ankyrin-G納米域與突觸周圍區(qū)域的Usp9X斑點(diǎn)相鄰或重疊。大多數(shù)棘在Usp9X周圍表現(xiàn)出兩個(gè)或多個(gè)ankyrin-G納米域。

????????為了探究ankyrin-G和Usp9X納米域的定位如何與樹突棘形態(tài)相關(guān)，盡管Usp9X存在于46.0%的樹突棘頭部，但僅在9.1%的樹突棘頸部觀察到了Usp9X。Ankyrin-G納米域存在于89.4%的樹突棘頭部和 52.0% 的樹突棘頸部，并且樹突棘頭部大小與樹突棘頭部和頸部中ankyrinG的存在相關(guān)。每個(gè)樹突棘的Usp9X納米域數(shù)量與樹突棘頭部區(qū)域相關(guān)，而每個(gè)樹突棘的Usp9X納米域總面積與樹突棘頭部大小以及樹突棘頭部?jī)?nèi)ankyrin-G納米域的數(shù)量和大小相關(guān)。

研究結(jié)論：多個(gè)ankyrin-G納米域與突觸周圍區(qū)域的Usp9X斑點(diǎn)相鄰或重疊。

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3.Usp9X通過Ankyrin-G穩(wěn)定調(diào)節(jié)樹突棘形態(tài)

????????最近的研究表明Usp9X在神經(jīng)元發(fā)育中發(fā)揮作用。因此，作者研究了Usp9X表達(dá)水平對(duì)成熟培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中樹突棘形態(tài)的影響。Usp9X敲低導(dǎo)致樹突棘頭部大小和密度顯著降低。相反，其肽酶結(jié)構(gòu)域的過度表達(dá)導(dǎo)致樹突棘頭部增大并回補(bǔ)了Usp9X敲低對(duì)樹突棘密度的影響。此外，Usp9X肽酶結(jié)構(gòu)域的過表達(dá)減弱了MG132 誘導(dǎo)的泛素化ankyrin-G的增加。此外，ankyrin-G與兩個(gè)突變D盒的表達(dá)增加了對(duì)照神經(jīng)元中的樹突棘大小，并挽救了表達(dá) shUsp9X的神經(jīng)元中的樹突棘密度。

研究結(jié)論：Usp9X介導(dǎo)的去泛素化穩(wěn)定了ankyrin-G水平并維持了樹突棘結(jié)構(gòu)。

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4.磷酸化增強(qiáng)了Usp9X與Ankyrin-G的相互作用? ? ?

????????作者假設(shè)Usp9X的磷酸化可能會(huì)改變蛋白質(zhì)之間的相互作用。為了研究磷酸化在調(diào)節(jié)Usp9X和ankyrin-G相互作用中的作用，作者基于Usp9X的晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)了可能的模型。? ? ?

????????為了確認(rèn)作者的同源性建模的預(yù)測(cè)，作者使用了原位鄰近連接分析 (PLA)，它在 16 nm 距離內(nèi)標(biāo)記蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用。在基礎(chǔ)條件下，PLA 信號(hào)表明ankyrin-G1-807 和Usp9X1555-1958的相互作用，但在磷酸空Usp9XS3A?共表達(dá)時(shí)不存在。相反，測(cè)試了每個(gè)絲氨酸（S1598D、S1600D、S1608D）的單個(gè)擬磷突變，并且 S1608D 與ankyrin-G的相互作用顯著增加。此外，所有三個(gè)絲氨酸位點(diǎn) (Usp9XS3D) 的誘變顯示出最強(qiáng)大的增強(qiáng)。為了測(cè)試這些殘基的突變是否會(huì)改變Usp9X的活性，作者使用重組表達(dá)的小鼠Usp9X 以及Usp9XS3A?和催化無(wú)效構(gòu)建體Usp9XH1878A?開發(fā)了一種體外 DUB 測(cè)定。每個(gè)Usp9X擬磷突變體都顯示出與ankyrin-G的相互作用增強(qiáng)，但它們的催化活性在體外沒有改變。? ? ?

????????為了研究Usp9X磷酸化在樹突棘中的作用，將Usp9XWt?或Usp9XS3A?與對(duì)照 RNAi 或 shUsp9X構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染到皮層培養(yǎng)的神經(jīng)元中。GFP-Usp9XS3A?的過表達(dá)顯著降低了棘的大小和密度，而 WT Usp9X1555-1958?的過表達(dá)回補(bǔ)了shUsp9X對(duì)棘的影響。這些數(shù)據(jù)表明Usp9X肽酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化可調(diào)節(jié)棘頭部的大小和密度。

????????PLA 方法允許在空間和定量上可視化相互作用的蛋白質(zhì)。為了觀察神經(jīng)元中內(nèi)源性ankyrin-G和突變的Usp9X的相互作用模式，作者用WT或S3D或S3A過表達(dá)FLAG-Usp9X。在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)，Usp9XS3D?中的 PLA 信號(hào)增加。因?yàn)樵?PLA 允許在空間和定量上可視化相互作用的蛋白質(zhì)，作者開發(fā)了一種將 PLA 與 SIM (PLA-SIM) 相結(jié)合的方法來研究棘內(nèi)Usp9X-ankyrin-G相互作用的空間組織及其與棘大小的關(guān)系。有趣的是，Usp9XS3D?增加了表達(dá)ankyrin G 的棘的比率，同時(shí)增加了 PLA 陽(yáng)性棘，并促使棘密度增加。表達(dá)ankyrin-G的樹突棘頭部明顯大于沒有ankyrin-G的樹突棘頭部。

研究結(jié)論：磷酸化增強(qiáng)了Usp9X與Ankyrin-G的相互作用。

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5.Usp9X在體內(nèi)穩(wěn)定多種ANKRD蛋白? ? ?

????????作者在體內(nèi)研究了原生小鼠大腦背景下ankyrin-G-Ups9x 相互作用的生理學(xué)。作者檢查了它們?cè)谛∈蟪跫?jí)體感皮層中的免疫熒光發(fā)現(xiàn)，ankyrin-G和Usp9X之間的重疊在樹突區(qū)域最強(qiáng)，而不是軸突初始段 (AIS)。Ankyrin-G和Usp9X在皮質(zhì)層 II-III、IV 層和 V 層中共同表達(dá)。? ?

????????為了評(píng)估Usp9X在維持ANKRD蛋白穩(wěn)態(tài)中的作用，作者分析了來自2周和12周大的 EmxDUsp9X條件性敲除小鼠的皮層裂解物，這些小鼠在背側(cè)端腦 (Usp9X-/Y) 中缺乏Usp9X。蛋白質(zhì)印跡顯示，與 WT 小鼠 (Usp9X+/Y) 相比，2 周時(shí)ankyrin-G的水平顯著降低。

????????因?yàn)锳NKRD是許多蛋白質(zhì)的共同域，作者想知道其他ANKRD蛋白質(zhì)的水平是否也受到影響。作者發(fā)現(xiàn)Usp9X-/Y?小鼠的ankyrin B、Shank3 和 TNKS2 水平也顯著降低，表明Usp9X在體內(nèi)穩(wěn)定多種ANKRD蛋白。為了估計(jì)去泛素化是否可能在調(diào)節(jié)含有ANKRD的突觸蛋白的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮更廣泛的作用，作者進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。作者發(fā)現(xiàn)ANKRD蛋白編碼基因在來自BD GWAS的全基因組顯著位點(diǎn)和與ASD和SZ相關(guān)的de novo變體中顯著富集，表明在神經(jīng)精神疾病中具有更廣泛的作用。在涉及神經(jīng)精神疾病的 59 種ANKRD蛋白中，據(jù)報(bào)道有20種在ANKRD中含有泛素化賴氨酸殘基，表明它們的蛋白穩(wěn)態(tài)可能通過 UPS 和 DUB 進(jìn)行調(diào)節(jié)。

研究結(jié)論：Usp9X在體內(nèi)穩(wěn)定多種ANKRD蛋白。

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6.Usp9X的缺失導(dǎo)致小鼠皮層樹突樹突棘密度的持續(xù)降低和Ankyrin-G泛素化和聚集的增加? ?

????????與降低的ANKRD蛋白水平一致，與Usp9X+/Y?相比，出生后2周Usp9X-/Y?小鼠額葉皮層III層的樹突棘密度顯著降低。令人驚訝的是，盡管Usp9X底物蛋白水平恢復(fù)，但12周大的Usp9X-/Y小鼠的樹突棘密度仍然降低。作者還通過IP等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在 2周齡時(shí)，ankyrin-G泛素化在WT和Usp9X-/Y小鼠中相似；然而，通過先天表達(dá)的免疫沉淀ankyrin-G的標(biāo)準(zhǔn)化比率顯示Usp9X-/Y小鼠中泛素化ankyrin-G的顯著增加。在第 12 周時(shí)，Usp9X-/Y皮質(zhì)中的ankyrin-G泛素化顯著高于 WT。

????????為了研究 12 周時(shí)Usp9X-/Y 皮層中ankyrin-G泛素化水平增加之間的明顯矛盾，作者檢查了ankyrin-G的分布。作者檢查了Usp9X-/Y和Usp9X+/Y小鼠額葉皮層中ankyrin-G的分布。2周后，與Usp9X+/Y小鼠相比，Usp9X-/Y小鼠的ankyrin-G免疫熒光降低。然而，令人驚訝的是，在 12 周時(shí)，ankyrin-G在Usp9X-/Y小鼠中顯著地重新分布成大的聚集體，這表明，雖然整體ankyrin-G水平恢復(fù)，但大部分隔離在大的聚集體中，可能是由于超泛素化。

研究結(jié)論：Usp9X在出生后發(fā)育過程中調(diào)節(jié)ANKRD蛋白穩(wěn)態(tài)和樹突棘形態(tài)發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，其影響持續(xù)到成年。

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7.Usp9X-/y小鼠在行為測(cè)試中表現(xiàn)出更高的活動(dòng)水平

????????作者接下來研究這些生化和解剖學(xué)改變是否也與神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān)的行為表型有關(guān)。編碼ANKRD蛋白的基因缺失的小鼠共有的表型域包括焦慮和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)水平的異常。因此，作者在Usp9X-/y?小鼠中研究了這些行為表型。首先，Usp9X-/y?小鼠的體重和新陳代謝正常。與對(duì)照相比，Usp9X-/y?小鼠在測(cè)試期間表現(xiàn)出更高的活動(dòng)水平。與多動(dòng)癥行為相一致，Usp9X-/y小鼠在高架迷宮和光/暗箱試驗(yàn)中也分別表現(xiàn)出每臂進(jìn)入次數(shù)和試驗(yàn)室轉(zhuǎn)換次數(shù)的顯著增加。在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中也觀察到較少的固定化現(xiàn)象。

研究結(jié)論：Usp9X-/y小鼠在行為測(cè)試中表現(xiàn)出更高的活動(dòng)水平。

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8.Usp9X催化域中的人類突變損害其活性和與ankyrin-G的相互作用? ? ?

????????由于USP9X的突變發(fā)生在ID、ASD和癲癇患者身上，作者想探究催化結(jié)構(gòu)域的這種突變是否影響與ankyrin- G的相互作用和/或DUB活性。作者測(cè)試了重組蛋白與ankyrin-G的相互作用能力。在一名發(fā)育障礙（DD）和語(yǔ)言遲緩的患者身上檢測(cè)到的Q1573L突變，以及在一名患有ID、DD和ASD的患者身上檢測(cè)到的L1693W突變，顯示出與ankyrin-G的正常相互作用，但在催化上沒有活性。? ? ?

????????基于已知DUB結(jié)構(gòu)的人類Usp9X同源模型表明 Q1573 和 L1693 位于緊密的內(nèi)部疏水核心內(nèi)，這些殘基的突變導(dǎo)致肽酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的空間沖突。這與觀察到的熱力學(xué)穩(wěn)定性增加一致，表明結(jié)構(gòu)靈活性降低，這一發(fā)現(xiàn)可能是催化活性改變的基礎(chǔ)。相反，表面暴露的突變G1890E不會(huì)影響體外蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或催化活性，但會(huì)破壞與ankyrin-G的相互作用，表明該突變可能通過改變蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用產(chǎn)生影響。

研究結(jié)論：Usp9X催化域中的人類突變損害其活性和與ankyrin-G的相互作用。

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結(jié)論與討論

????????作者通過篩選發(fā)現(xiàn)ankyrin-G與Usp9X相互作用。磷酸化增強(qiáng)Usp9X/ankyrin-G相互作用，減少ankyrin-G多泛素化，并穩(wěn)定ankyrin-G，以維持樹突棘。超分辨率顯微鏡揭示了該通路的突觸后空間組織。在前腦特異性Usp9X條件性敲除(Usp9X-Y)小鼠中，多種ANKRD蛋白的水平在2歲時(shí)暫時(shí)降低， 但在出生后12周時(shí)恢復(fù)。作者的數(shù)據(jù)提供了對(duì)突觸中含有ANKRD蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)以及突觸DUB生物學(xué)的洞察?？傊芯拷Y(jié)果表明，在突觸成熟的整個(gè)生命周期中去泛素化對(duì)于皮層突觸的正確發(fā)育軌跡至關(guān)重要，其改變導(dǎo)致行為和臨床異常。

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Thank you!

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.11.003