首都醫(yī)科大學(xué)羅大力教授團(tuán)隊(duì)在 Circulation 雜志發(fā)表了題為“Functional Calsequestrin-1 Is Expressed in the Heart and Its Deficiency Is Causally Related to Malignant Hyperthermia-Like Arrhythmia”的文章，闡明了異氟烷或高熱造成的 Casq1 解聚化可降低其對雷諾定受體 2(Ryanodine receptor-2, RyR2)介導(dǎo)的鈣釋放的抑制作用，從而引起惡性高熱(malignant hyperthermia, MH)和環(huán)境中暑(environmental heat stroke, EHS)樣心律失常。

背景：

鈣螯合蛋白(Casqs)，包括 Casq1（骨骼肌型）和 Casq2（心肌型）兩種亞型，可以分別緩沖 Ca2+、調(diào)節(jié)在骨骼肌和心肌肌漿網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum，SR）內(nèi)鈣的釋放。Casq1 或 Casq2 突變可導(dǎo)致人類遺傳疾病包括 MH/ EHS 和兒茶酚胺能多態(tài)性室性心動過速（catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT)）。

CPVT 的 主 要 誘 發(fā) 原 因 是 心 肌 SR 中 編 碼 RyR2 (ryanodinereceptor-2) (Ca2+釋放通道的組成部分)和 Casq2 (calsequestrin-2) (Ca2+緩沖蛋白)的基因突變。舒張期過早自發(fā)性 SR Ca2+釋放、Na+/Ca2+交換體激活和去極化遲后除極(DADs)的產(chǎn)生是發(fā)生 CPVT 的高風(fēng)險因素。MH/EHS 是一種遺傳性亞臨床肌肉病，由揮發(fā)性麻醉藥、去極化肌肉松弛劑、劇烈運(yùn)動、發(fā)熱引發(fā)，包括心動過速、高碳酸血癥、肌肉強(qiáng)直、高熱、酸中毒和橫紋肌溶解等癥狀。丹曲林，一種 RyR 拮抗劑，是專門用于治療 MH/EHS 的藥物。尚未在心臟中檢測到 Casq1 蛋白表達(dá)，但 Casq1 基因在人類心臟和大鼠心室表達(dá)的線索已被揭示，Casq1 內(nèi)含子 2 的變異與白種人的靜息心率加快有關(guān)。因此，作者假設(shè) Casq1 也在心臟中表達(dá)，且可作為獨(dú)立致病因素，在其改變時，探究是否可引起 MH/EHS 樣心律失常。

關(guān)鍵詞：

麻醉藥、心律失常、鈣螯合蛋白、惡性高熱、CPVT、聚合反應(yīng)

方法：

RT- PCR、western blot、免疫共沉淀、化學(xué)交聯(lián)、電標(biāo)測 Electrical Mapping

一、野生型和 Casq1-KO 小鼠在麻醉后被肝素化并處死。

二、快速切除心臟并安裝在 Langendorff 裝置上，通過主動脈逆行灌注Tyrode 溶液，其中含有（以 mmol/L 為單位）NaCl 137、KCl 5.4、MgCl2 1.2、NaH2PO4 1.2、D-葡萄糖 10、HEPES 20 和 CaCl2 1.8（pH7.4)，用 95% O2-5% CO2 氣體混合物充氧，溫度保持在 37oC。穩(wěn)定10 分鐘后，進(jìn)行心電圖記錄。

三、測量心電圖后，將 64 個電極（8×8 個網(wǎng)格；6 mm×6 mm 面積；0.20 mm 電極直徑；0.36 mm 電極間距）與電標(biāo)測系統(tǒng)（MappingLab,United Kingdom)用于記錄竇性心律下左心室游離壁的心外膜標(biāo)測。

四、使用 EMapRecord 記錄標(biāo)測數(shù)據(jù)并通過 EMapScope 軟件進(jìn)行分析。

結(jié)果：

1、Casq1 亞型在小鼠和人心臟中的表達(dá)

作者通過 western blot、免疫染色、化學(xué)交聯(lián)等技術(shù)，分析了 Casq1在大鼠和小鼠心臟、乳鼠心肌細(xì)胞（NRVMs）和大鼠胚胎心肌細(xì)胞系(H9C2)中的表達(dá)來研究 Casq1 是否在心臟中表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，Casq1 mRNA 和蛋白在所有組織和細(xì)胞裂解液中的表達(dá)低于 Casq2(圖 1A 和 1B)；在小鼠心室和心房的 SR 中，Casq1 以低分子量單體和高分子量樣蛋白的形式大量表達(dá)，這可能是骨骼肌中Casq1 的聚合形式(圖 1C)；進(jìn)一步通過試劑交聯(lián)法分析，Casq1 主要以聚合物的形式出現(xiàn)，而 Casq2 則以其單體、二聚體和三聚體構(gòu)象存在(圖 1D)。Casq1 蛋白在二尖瓣反流和心肌肥厚患者的心耳和心室中也有表達(dá)，心室中 Casq1 被修飾成更大的分子量(圖 1E)， Casq1 單體在人心耳和小鼠心室中也被發(fā)現(xiàn)具有相似的分子量。對小鼠心室和心肌細(xì)胞的免疫染色分析表明，在 Casq1 染色的心室中觀察到細(xì)胞間隙的非特異性標(biāo)記，但在分離的心肌細(xì)胞中沒有觀察到標(biāo)記(圖 1F)。

2、異氟烷誘導(dǎo) Casq1-CKO 和 Casq1-KO 小鼠 MH 樣心動過速

為了確定 Casq1 在心臟中的功能，作者構(gòu)建了心臟特異性敲除(Casq1- cko)和全身敲除(Casq1- ko)小鼠模型，并通過心電圖與電標(biāo)測技術(shù)檢測兩種小鼠在異氟烷誘導(dǎo)下是否出現(xiàn) MH 樣心動過速。

結(jié)果顯示，1%異氟烷存在時，Casq1-KO 和 Casq1-CKO 小鼠的基礎(chǔ)心率增加，異丙腎上腺素（ISO）刺激交感神經(jīng)后，小鼠的心率加快(圖 2A-C)，但無 Casq2-KO 小鼠中發(fā)現(xiàn)的任何 CPVT 跡象。在Langendorff 灌注心臟中，心電圖顯示竇性心率增加(圖 2D)和在體結(jié)果相似。此外，心外膜電標(biāo)測在同一 Casq1-KO 或 Casq1-CKO 小鼠中顯示出異位自發(fā)放電和頻繁的室性早搏或偶發(fā)性室性心動過速(圖2E)，提示異常放電和心動過速與軀體神經(jīng)調(diào)節(jié)無關(guān)。異氟烷用量增加到 2%時, 在病人和動物模型中均可誘導(dǎo) MH 事件, Casq1-KO 和Casq1-CKO 小鼠表現(xiàn)出丹曲林敏感的室性早搏和單向室性心動過速(圖 2B 和 2C)，與 Casq2 缺陷小鼠和暴露于誘導(dǎo)劑的多型或多態(tài)室性心動過速患者的 CPVT 不同。

3、升高的 Ca2+波和過早的 Ca2+瞬變是 MH 樣心律失常的原因

SR 中 Ca2+含量和循環(huán)的紊亂可能導(dǎo)致細(xì)胞電穩(wěn)態(tài)紊亂，從而誘發(fā) DADs 和 EADs。作者通過共聚焦技術(shù)檢測了 Casq1-CKO 小鼠新鮮分離和刺激條件下的心肌細(xì)胞內(nèi)的 Ca2+活性。

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結(jié)果顯示，與 WT 小鼠的心肌細(xì)胞相比(圖 3A)， Casq1-CKO 小鼠心肌細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下表現(xiàn)出更高的舒張期 Ca2+早期瞬變(PCT)和Ca2+振蕩(CO)頻率，并且在 2%異氟烷下，PCT 和 CO 頻率顯著增加。

在本研究中，局部或全部 Ca2+提前釋放通常是一個持續(xù)的過程，影響Ca2+基線的平穩(wěn)(圖 3A1);因此，異氟烷誘導(dǎo)的 Ca2+異常信號被分為兩種類型:即 PCT 和 CO。在 Casq1-CKO 肌細(xì)胞中，單個細(xì)胞 Ca2+瞬態(tài)間歇期間的 PCT 發(fā)生率要高得多(圖 3A3)。與對照組相比，Ca2+瞬變的基線和振幅沒有改變，無論異氟烷是否存在，達(dá)到 50%峰值的時間均顯著減少(圖 3B)。Casq1-CKO 肌細(xì)胞和異氟烷觸發(fā)的 Ca2+火花和鈣波(遍及整個細(xì)胞)的增加，在異氟烷存在時尤為顯著(圖 3C)。研究發(fā)現(xiàn)，在基線和異氟烷處理的 Casq1-CKO 心肌細(xì)胞中，SR Ca2+泄漏與對照組相比沒有差異，對照組和 Casq1- CKO 肌細(xì)胞 Ca2+泄漏指數(shù)增加與 SR Ca2+含量增加的關(guān)系無明顯差異(圖 3D)。

4、Casq1-KO 小鼠中 RyR 活性的上調(diào)與室性心律失常有關(guān)

既往研究表明，Casq1 和 RyR1 通過支架蛋白 triadin 和 junctin 相互作用，跨越 SR 膜，并通過其腔域結(jié)合到骨骼肌中的 Casq1 和 RyR1。為了研究 Casq1 與心臟 SR 蛋白的關(guān)聯(lián)，作者用免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，為了進(jìn)一步研究 Casq1/RyR2 在心臟中的關(guān)系，作者使用 Casq1-siRNA 分析 Casq1 表達(dá)改變與功能異常之間的關(guān)系，使用過度表達(dá)Casq1 (Casq1- wt)或編碼 Casq1 Ca2+結(jié)合域的剪切 Casq1 基因(c -末端9 個氨基酸[Casq1- Δ9])，腺病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的 NRVM Casq1 mRNA 和蛋白表達(dá)，檢測其相關(guān)關(guān)系。

結(jié)果顯示，Casq1-CKO 小鼠中 Casq1 單體/二聚體與 RyR2 的相互作用顯著減少，但與 WT 相比，聚合物與 RyR2 的相互作用和共定位在心室中保持不變(圖 4B 和 4C)。

結(jié)果顯示，在 Casq1 敲低的細(xì)胞中，Junctin 的表達(dá)減少 (圖 5A和 5B)。與 Casq1-wt 細(xì)胞相比，Casq1-Δ9 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了大量的 Casq1單體，但較少的聚合物(圖 5C)。Casq1-wt 細(xì)胞中 RyR2 的表達(dá)下降，而 Casq1-Δ9 細(xì)胞中則沒有。Casq1-Δ9 細(xì)胞中 triadin 和 junctin 的表達(dá)減少，這可能是由于剪切干擾了其與 triadin/junctin 的相互作用導(dǎo)致(圖 5D)。

功能評估顯示，在 Casq1 敲除細(xì)胞中，2%的異氟烷存在下，竇性自發(fā) Ca2+瞬變增加，Ca2+振蕩增加，并且 SR 中咖啡因誘導(dǎo)的 Ca2+釋放含量和達(dá)到 50%峰值的時間降低(圖 6A)。相反，Casq1-wt 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，與載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，Ca2+瞬時速率和振幅降低，SR 中Ca2+含量更高(圖 6B)。在 Casq1 敲除的細(xì)胞中，2%的異氟烷也會增加 Ca2+火花(圖 6C)，而 Casq1 過表達(dá)的細(xì)胞中竇性鈣火花會減少，Casq1-Δ9 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中則沒有減少(圖 6D)。

5、異氟醚或環(huán)境熱引起的 Casq1 解聚可導(dǎo)致 MH/EHS 樣心律失常

最后，作者調(diào)查了為什么 MH/ EHS 樣心律失常是由特定的誘因如異氟烷和高熱引起的。由于 Casq1 的構(gòu)象對其功能的實(shí)現(xiàn)非常重要，作者采用了交聯(lián)法檢測 WT 心室中 Casq1 的構(gòu)象是否在 2%異氟醚下發(fā)生改變。

結(jié)果顯示，正常心室在異氟烷處理，而未使用 ISO 治療的情況下，Casq1 以單體形式存在較多，聚合物形式較少，并顯示出高分子量(在800 kDa) RyR2 復(fù)合體減少，而 Casq2 保持不變的構(gòu)象（圖 7A）。異氟烷存在時，Casq1- CKO 心室發(fā)生更多的解聚反應(yīng)(圖 7B)。通過交聯(lián)法和 Western blot 分析發(fā)現(xiàn)，異氟烷存在下，Casq1 和 Casq1/RyR2復(fù)合物(800 kDa)顯著下降(圖 7C)，表明 Casq1 與 RyR2 的結(jié)合被破壞。41℃加熱時，WT 心室中也發(fā)現(xiàn)了較強(qiáng)的 Casq1 寡聚甚至變性(圖 7D)，這是易感患者 EHS 的誘導(dǎo)劑。為了避免組織對熱的反應(yīng)，作者直接處理大鼠心室和腓腸肌的 SR 裂解液，41℃加熱，觀察到大鼠兩種類型的肌肉中Casq1顯著的寡聚(圖8A)，就像在小鼠中觀察到的一樣(圖7D)。綜上所述，Casq1 的構(gòu)象變化對揮發(fā)性麻醉劑和高溫敏感。

結(jié)論:

本文首次證明了 Casq1 在心臟中表達(dá)且可緩沖肌漿網(wǎng) Ca2+和調(diào)節(jié)基礎(chǔ)心率。Casq1 缺乏可導(dǎo)致竇性心動過速、舒張期自發(fā)性鈣釋放增加和可誘導(dǎo)的室性心動過速。異氟烷和高熱是 MH/EHS 的特異性誘因，可引起 Casq1 寡聚化，降低其對 RyR 的調(diào)節(jié)作用，從而在MH/EHS 患者中引起室性心動過速。

解析文獻(xiàn)：

[1] Sun, Z. , Wang, L. , Han, L. , Wang, Y. , & Luo,D. . Functional calsequestrin-1 is expressed in the heart and its deficiency?is causally related to malignant hyperthermia-like arrhythmia. Circulation,144(10), 788-804.