長片段基因在大腸桿菌中表達(dá)往往比較困難，作為抗原使用的重組蛋白可以考慮選擇抗原性好的區(qū)段原核表達(dá)，前文已作闡述。對整個蛋白結(jié)構(gòu)研究，必須全長表達(dá)該蛋白，此時最好考慮真核表達(dá)系統(tǒng)，特別是含有跨膜區(qū)的蛋白。

選定要克隆的區(qū)段，需先富集純化之后才方便插入載體，常用的富集方法是PCR或者質(zhì)粒繁殖復(fù)制。為了防止在PCR擴增過程中引入堿基錯誤或者堿基缺失，PCR擴增基因時候必須使用高保真Taq酶。為了滿足科研工作者不同實驗需求，福因德生物將高保真Taq酶優(yōu)化為即用型Mix，使用時直接加引物和模板就可以擴增。 除此之外，福因德生物還開發(fā)出LA Taq、S-Taq Mix 以及SYBR熒光定量PCR Mix(需要更高品質(zhì)的可選用SYBR PCR SuperMix)。

原核重組表達(dá)常用克隆技術(shù)主要有以下幾種：

1. 酶切連接

這個是目前應(yīng)用最為廣泛的的克隆技術(shù)，主要優(yōu)點是技術(shù)穩(wěn)定；缺點是周期長、步驟多，任何一個環(huán)節(jié)產(chǎn)生的誤差都會影響克隆構(gòu)建的成敗。如用酶切連接的策略進(jìn)行載體批量構(gòu)建，不同載體和不同外源基因盡可能選用相同的上下游酶切位點，比如，批量克隆基因到某個載體上，可一次性大量雙酶切將載體線性化后保存?zhèn)溆茫看螛?gòu)建載體只需酶切外源基因片段，載體可直接取用，不必每次都酶切，省時省力（此處需特別留意的是基因內(nèi)部不能有與上述所用沖突的酶切位點）。

2.?TA克隆

TA克隆必須使用商業(yè)的線性化載體，線性載體3′末端有一個T堿基，與PCR擴增產(chǎn)物3′末端A正好匹配。這種克隆策略最大的優(yōu)點是載體使用方便，擴增產(chǎn)物可以直接克隆到載體上，不需要酶切位點等冗余序列；缺點是：必須依賴商業(yè)化載體，載體選擇受限；擴增外源片段所使用的Taq酶也必須是可以在3′末端加A，這種Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后還必須鑒定方向。目前，這種構(gòu)建表達(dá)載體的策略已經(jīng)逐漸被淘汰。

3.?TOPO克隆

TOPO克隆載體利用DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I識別序列中的CCCTT松弛雙螺旋并重新連接，同時兼具限制性內(nèi)切酶和連接酶的功能。主要原理是在T載體的T堿基上共價偶聯(lián)一個DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I分子，其克隆效率提高數(shù)倍，并且操作極其簡單，整個反應(yīng)體系不需要在添加連接酶成分。如果在線性化平端載體上共價偶聯(lián)一個DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I分子，平端連接將不再是難題，如果再配合一個致死基因ccdB （Control of cell death）使用，凡是沒有插入外源核酸序列的空載體自連，轉(zhuǎn)入大腸桿菌可以正常表達(dá)ccdB蛋白，破壞細(xì)菌DNA gyrase(促旋酶)，造成細(xì)菌染色體降解而死亡；而插入外源核酸序列的會干擾ccdB蛋白的正常表達(dá)，細(xì)菌可以正常存活，平端克隆高背景問題這樣得以完美解決。

4.?Gateway技術(shù)

該技術(shù)所依賴的基礎(chǔ)是lambda噬菌體的位點特異性重組反應(yīng)。需要限制酶切回收、T4 Ligase連接；該方法一步就可以完成，只需要將基因克隆到入門載體（Entry Vector）,依賴載體上的特定的重組序列和重組酶，將外源基因克隆到具有相同重組序列的載體上；入門載體一般包含兩個attL1和attL2,中間夾雜一個ccdB自殺基因，自連的空載體在轉(zhuǎn)入大腸桿菌中都不會存活。入門載體構(gòu)建成功之后，就可以輕松地將入門載體和目的載體質(zhì)?；旌霞尤胫亟M酶即可發(fā)生重組，生成所需要的融合質(zhì)粒，當(dāng)然還有一個副產(chǎn)品質(zhì)粒。這種克隆方法適合于將一個基因批量化構(gòu)建到不同載體系列中進(jìn)行功能測試。這種技術(shù)也適合于大批量的文庫構(gòu)建，具體細(xì)節(jié)在此就不做贅述。

該技術(shù)主要的缺點是：該技術(shù)系統(tǒng)使用的酶非常昂貴，而且酶非常不穩(wěn)定；其次，適合于gateway技術(shù)的載體非常少，只有一個廠家生產(chǎn)而且昂貴，來源受限；對于大片度（>10Kb）的效率很低，與傳統(tǒng)的酶切-T4連接技術(shù)相比沒有優(yōu)勢。

5.?Infusion技術(shù)

這個是目前比較流行的克隆技術(shù)，可以任意載體任意基因片段快速實現(xiàn)多片段、長片段定點定向克隆，最大的優(yōu)點在于不依賴于酶切位點進(jìn)行克隆，操作時間也非常短，只需要10～15min；缺點是：載體和外源片段連接處的重疊15bp必須堅持末端原則，不能“甩出”，這也限制了定點克隆的“任意發(fā)揮”。

6. Frdbio SimpleClone技術(shù)

本克隆技術(shù)是在福因德生物基礎(chǔ)團(tuán)隊在Infusion技術(shù)上的升級，除了兼具Infusion技術(shù)的全部優(yōu)勢外，還具有以下特點：克隆片段重疊區(qū)可以少于15bp,最短可以至10bp,反應(yīng)溫度50℃，載體線性化之后，重疊區(qū)可不必末端對齊，可以“允許末端甩出”，實現(xiàn)真正意義上的任意位點克隆。

下面介紹兩種比較常用的構(gòu)建方式：

A 酶切連接法構(gòu)建載體

1）50 μl酶切體系: PCR回收產(chǎn)物 /載體～2μg,限制性內(nèi)切酶A 1μl (10U), 限制性內(nèi)切酶B 1μl (10U),雙酶切Buffer 5μl，H2O補充至50μl；37℃ 連接4～6h。

2）10 μl連接體系: 酶切PCR回收產(chǎn)物與酶切線性化載體摩爾比為10:1，Ligase 0.5μl，10*Ligase Buffer 1μl, H2O補足至10μl（體系中線性化載體濃度不低于10ng/μl），16℃ 連接過夜。

連接產(chǎn)物可用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

B Simpleclone重組酶法構(gòu)建載體

1）載體線性化：

? ?載體線性化同上文“SOP3酶切連接法構(gòu)建載體”。

2）外源片段的獲得：參照Simpleclone重組酶說明書設(shè)計引物并擴增獲得，保證兩端分別與線性化載體末端有15nt重疊區(qū)。

3）反應(yīng)體系的配制(10μl)：

實驗組：線性化載體 50ng，外源插入片段50ng，5×Simpleclone重組連接反應(yīng)液 2μl，補足水至10μl；

陰性對照組：線性化載體 50ng，外源插入片段50ng，補足水至10μl；

陽性對照組：線性化載體pUC19 Control Vector20 ng，外源插入片段2 kb Control Insert fragment 50ng，5×Simpleclone重組連接反應(yīng)液 2μl，補足水至10 μl ；

4）將以上體系配置好在PCR管底部（陰性對照和陽性對照實驗可選做），配好后放在PCR儀上或水浴鍋中50℃ 15min。