以下文章來(lái)源于康體生命公眾號(hào)，作者康體生命

前言

包涵體在原核表達(dá)中非常常見(jiàn)，但是沒(méi)有一個(gè)通用的復(fù)性解決方案，常用的復(fù)性手段有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、分子篩及離子柱層析等，復(fù)性遵循原則：低溫、低濃度、小梯度，下面我們分享三個(gè)蛋白復(fù)性的實(shí)例。

先復(fù)性后純化

1. 細(xì)菌破碎后離心收集沉淀，trisbuffer洗滌包涵體3-5次，跑膠檢測(cè)包涵體純度

2. 用5-10ml 6M鹽酸胍（ph1.5）溶解包涵體，室溫?cái)嚢?0min-1h，離心去除不溶物；

3. 將溶解后包涵體蛋白快速滴定到4℃預(yù)冷pbs中，緩慢攪拌，過(guò)夜復(fù)性，離心去除沉淀；

4. 緩慢加（40%）硫酸銨，3h后離心去沉淀（未完全復(fù)性的蛋白）；加終濃度70%硫酸銨，4℃過(guò)夜孵育，離心取沉淀，溶解到5-10ml pbs中即為目的蛋白。

復(fù)性結(jié)果如下圖所示

圖1.包涵體檢測(cè)

泳道1：鹽酸胍溶解包涵體? 泳道2：包涵體洗滌后

圖2.蛋白復(fù)性后檢測(cè)

先復(fù)性后純化

1. 破胞后洗滌沉淀，沉淀用變性劑buffer（8M脲）室溫溶解3h后高速離心去除沉淀，上清中加入Ni填料，4℃混勻孵育2h；

2. 孵育結(jié)束后轉(zhuǎn)移beads至層析柱，依次用不同濃度咪唑Wash buffer沖洗柱子；

3. Elute buffer洗脫蛋白后跑膠檢測(cè)純度；

4. 包涵體復(fù)性：變性蛋白測(cè)濃度后滴定入復(fù)性buffer（ 100 mM Tris–HCl, 0.5M 甘氨酸, 1 mM氧化型谷胱甘肽,10 mM 還原型谷胱甘肽, pH8.0） ，使蛋白終濃度為0.1mg/ml， 緩慢攪拌，4℃復(fù)性反應(yīng)過(guò)夜，離心去除沉淀，上清轉(zhuǎn)移到透析袋，pbs透析4h，換液至少2次，濃縮后過(guò)分子篩。

復(fù)性結(jié)果如下圖所示

圖3.包涵體純化結(jié)果

泳道1為包涵體溶解后上清，泳道2為包涵體溶解后沉淀，泳道3為20mM洗雜，泳道4為40mM洗雜，泳道5為60mM洗雜，泳道6為100mM洗雜，泳道7為300mM洗脫，泳道8、9為500mM洗脫

圖4.復(fù)性后檢測(cè)結(jié)果

柱上復(fù)性

層析柱上復(fù)性與普通親和層析操作類似，只是在細(xì)胞破碎時(shí)候用變性buffer（如8M脲），離心后上清蛋白溶液正常上層析柱，洗雜過(guò)程中依次降低變性劑含量，如8M-6M-4M-2M-1M-0.5M-0，使蛋白在層析柱上復(fù)性，最后用不含變性劑的咪唑buffer洗脫，即可得到復(fù)性后蛋白，實(shí)例圖如下：

圖5.親和層析結(jié)果

泳道1為誘導(dǎo)前，泳道2為誘導(dǎo)后，泳道3為破碎后沉淀（變性劑破碎），泳道4為破碎后上清（變性劑破碎），泳道5為，泳道6為6M尿素洗雜，泳道7為4M尿素洗雜，泳道8為2M尿素洗雜，泳道9為1 M尿素洗雜，泳道10為0.5M尿素洗雜，泳道11為0M尿素復(fù)性洗雜，泳道12為300mM咪唑洗脫，泳道13、14為500mM咪唑洗脫。

復(fù)性洗脫后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求再進(jìn)一步純化即可。

小結(jié)
包涵體形成原因較多，方法也就不一而論，需要各種嘗試才能找到一個(gè)合適的方法，需要一點(diǎn)運(yùn)氣，更需要的是對(duì)科研的探索精神。