文章：Identifying a confused cell identity for esophageal squamous cell carcinoma

期刊：Signal Transduct Target Ther， 2022 ，IF 13.493

技術(shù)：ScRNA Seq

導(dǎo)語(yǔ)

惡性細(xì)胞的細(xì)胞特性及其產(chǎn)生是理解癌癥的基礎(chǔ)。作者研究發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）細(xì)胞顯示出與所有三種正常食管上皮細(xì)胞相同但不同的分子特征，作者稱(chēng)之為混淆細(xì)胞身份（CCI）。CCI是與ESCC不良預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。此外，還鑒定出TPM4是促進(jìn)ESCC體內(nèi)外侵襲性的關(guān)鍵CCI基因。TPM4通過(guò)激活Jak/STAT-SOX2通路來(lái)產(chǎn)生CCI。因此，作者研究提示了ESCC細(xì)胞的一個(gè)未知的特征，這可能對(duì)臨床預(yù)后和潛在干擾有價(jià)值。

研究結(jié)果

1. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示CCI是ESCC細(xì)胞的獨(dú)特特征

采用 10× Genomics單細(xì)胞測(cè)序分析了7例ESCC樣本和1例對(duì)照正常食管樣本。共獲得44,206個(gè)細(xì)胞，鑒定了鱗狀上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和其他腫瘤微環(huán)境細(xì)胞（圖1a，b，c）。通過(guò) inferCNV分析，患者的鱗狀上皮細(xì)胞有明顯的拷貝數(shù)變化，被鑒定為ESCC細(xì)胞。在正常食管組織中，食管鱗狀上皮細(xì)胞由三種主要類(lèi)型的細(xì)胞組成，包括基底干細(xì)胞（BS）、增殖的基層角質(zhì)細(xì)胞（BK）和分化角質(zhì)細(xì)胞（DK）。這些細(xì)胞在形態(tài)、定位、分化和分子特征彼此不同，BS可以通過(guò)逐步分化產(chǎn)生BK和DK。發(fā)現(xiàn)正常鱗狀上皮細(xì)胞可以分為三個(gè)連續(xù)的亞群。作者的數(shù)據(jù)集和人類(lèi)細(xì)胞圖譜食管數(shù)據(jù)集中4885個(gè)細(xì)胞的組合觀察到了類(lèi)似的三個(gè)亞群（圖1d）。其中BS表達(dá)SOX2、TP63和KRT15，BK高表達(dá)KRT5，DK表達(dá)KRT14、KRT13和IVL這些marker基因。無(wú)監(jiān)督的命運(yùn)圖顯示了從BS到BK和DK的偽軌跡（圖1d）。

為了可視化ESCC細(xì)胞與正常食管鱗狀上皮細(xì)胞的關(guān)系，創(chuàng)建了BS、BK和DK的三元圖（圖1e）。所有惡性細(xì)胞都落在三角形的中心，與每個(gè)角落的距離相等?；虮磉_(dá)熱圖顯示ESCC細(xì)胞表達(dá)BS、BK和DK的所有marker基因，盡管水平略低（圖1f）。同時(shí)，惡性細(xì)胞中檢測(cè)到的基因平均數(shù)量明顯多于正常細(xì)胞（圖1 g）。作者將這種相對(duì)于正常細(xì)胞的新細(xì)胞身份稱(chēng)為混淆細(xì)胞身份（CCI）。為了量化三元圖上每個(gè)單元格的CCI，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)CCI分?jǐn)?shù)，通過(guò)計(jì)算三個(gè)角度的余弦值的標(biāo)準(zhǔn)差，以單元格位置的點(diǎn)為頂點(diǎn)，點(diǎn)到每個(gè)角的連接線和原點(diǎn)為射線。正常細(xì)胞的CCI評(píng)分中值為21.2，惡性細(xì)胞為43.2（圖1h）。作者認(rèn)為CCI是惡性細(xì)胞的一個(gè)新的分子特征。

2. CCI是ESCC在多個(gè)隊(duì)列中的特征

分析發(fā)現(xiàn)，具有侵襲性進(jìn)展的ESCC患者的平均CCI評(píng)分明顯更高（圖2a）。在已發(fā)表的60名ESCC患者隊(duì)列中，有16名I期和44名II/III期患者，早期患者的CCI評(píng)分顯著低于晚期患者（圖2b）。在單細(xì)胞水平上，CCI評(píng)分與ESCC晚期特異性基因的表達(dá)顯著正相關(guān)（圖2c）。

在TCGA ESCC的81名患者中，作者發(fā)現(xiàn)所有II/III期患者位于CCI圖的中心，而I期患者的位置接近DK的角落（圖2d）。高級(jí)別患者的平均CCI評(píng)分顯著高于I期患者（22.1對(duì)38.7，p?=?0.028）（圖2e）。同時(shí)，CCI評(píng)分高的患者預(yù)后明顯低于CCI評(píng)分低的患者（中位生存時(shí)間484 vs.1263天，p?=?0.02）（圖2f）。多個(gè)隊(duì)列數(shù)據(jù)分析表明，CCI評(píng)分可以作為ESCC患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。

3. CCI的分子機(jī)制

通過(guò)比較CCI陽(yáng)性細(xì)胞和陰性上皮細(xì)胞來(lái)鑒定CCI標(biāo)志基因。195個(gè)基因被鑒定為ESCC的CCI標(biāo)志基因；在CCI圖上，CCI標(biāo)志基因在三個(gè)角的正常細(xì)胞中不表達(dá)，而在中心的惡性細(xì)胞中高度表達(dá)（圖3a）。同時(shí)，這些CCI標(biāo)志基因的表達(dá)水平與CCI評(píng)分顯著正相關(guān)（圖3b）。

CCI標(biāo)志基因在ESCC患者中，在蛋白質(zhì)水平上高度表達(dá)的有六個(gè)：CBR1、GSTM3、HSPB1、MIF、PGK1和TPM4（圖3c）。其中包括原肌球蛋白4（TPM4）在ESCC患者中具有最高的診斷價(jià)值，也是ESCC和各種癌癥中蛋白質(zhì)水平上調(diào)最多的基因之一，同時(shí)TPM4高表達(dá)與不良預(yù)后顯著相關(guān)（圖3e）。TPM4的表達(dá)水平與單細(xì)胞水平和患者水平的CCI評(píng)分顯著正相關(guān)（圖3f，g）。因此，作者認(rèn)為T(mén)PM4是CCI基因。

4. TPM4過(guò)表達(dá)增加CCI評(píng)分，TPM4促進(jìn)小鼠ESCC轉(zhuǎn)移

在食管的類(lèi)器官中過(guò)表達(dá)TPM4，對(duì)類(lèi)器官的大小沒(méi)有顯著影響。傳代以后，類(lèi)器官產(chǎn)生了更多的次級(jí)類(lèi)器官，表明TPM4促進(jìn)了祖細(xì)胞的自我更新（圖3h）。相反，敲除Tpm4顯著減少了食管類(lèi)器官的形成（圖3i）。因此，TPM4可能不是細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)所必需的，但對(duì)食管上皮類(lèi)器官的自我更新至關(guān)重要。Tpm4過(guò)表達(dá)類(lèi)器官的CCI得分顯著高于對(duì)照器官（圖3k）?？傊?，TPM4促進(jìn)了食管上皮細(xì)胞的CCI。

在小鼠ESCC類(lèi)器官中過(guò)表達(dá)Tpm4，將對(duì)照和Tpm4過(guò)表達(dá)的ESCC類(lèi)器官原位植入受體食管上皮層下。熒光活體成像顯示，Tpm4過(guò)表達(dá)腫瘤的熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照腫瘤（圖4a，b）?；顧z顯示Tpm4過(guò)表達(dá)的巨大腫瘤擴(kuò)散到整個(gè)胃，而對(duì)照腫瘤僅限于移植部位（圖4c）。實(shí)驗(yàn)表明Tpm4過(guò)表達(dá)的腫瘤比對(duì)照組更具侵襲性。

有趣的是，作者在Tpm4腫瘤的受體小鼠的多個(gè)部位發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)烈的熒光信號(hào)（圖4a）?；顧z顯示，Tpm4小鼠在許多器官上顯示出特異性的信號(hào)通路，包括肝臟、脾臟和淋巴結(jié)，這是患者ESCC轉(zhuǎn)移的熱點(diǎn)。所有6名Tpm4受體的肝臟和淋巴結(jié)均有轉(zhuǎn)移，而六名對(duì)照ESCC患者中只有一人在肝臟有轉(zhuǎn)移，而沒(méi)有一人在其他器官有轉(zhuǎn)移（圖4f）。

5. ESCC中CCI的TPM4 Jak/STAT-SOX2軸

將對(duì)照和TPM4過(guò)表達(dá)的食管類(lèi)器官進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果表明，Jak/STAT信號(hào)通路是Tpm4上調(diào)最多的通路之一（圖4g）。IHC染色也證實(shí)，與對(duì)照腫瘤相比，Tpm4腫瘤的p-Jak2和p-STAT3水平增加（圖4h）。而且Tpm4過(guò)表達(dá)的ESCC類(lèi)器官對(duì)Jak2特異性抑制劑AZ960的敏感性顯著高于對(duì)照組（圖4j）。已報(bào)道中Jak/STAT途徑可以上調(diào)SOX2，SOX2是細(xì)胞身份和ESCC進(jìn)展的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。與對(duì)照腫瘤相比，Tpm4過(guò)表達(dá)的ESCC腫瘤類(lèi)器官的SOX2染色增加（圖4k），WB顯示過(guò)表達(dá)TPM4，SOX2表達(dá)上調(diào)，而敲除TPM4，SOX2表達(dá)下調(diào)（圖4i）。而且加入AZ960降低了體外和體內(nèi)SOX2水平（圖4k）。

最后，作者發(fā)現(xiàn)Jak/STAT信號(hào)通路基因的表達(dá)水平與ESCC中的CCI評(píng)分顯著正相關(guān)（圖4l）。重要的是，AZ960對(duì)Jak/STAT通路的抑制顯著降低了ESCC細(xì)胞的CCI分?jǐn)?shù)，并將Tpm4過(guò)表達(dá)的ESCC細(xì)胞從CCI圖的中心驅(qū)動(dòng)到DK側(cè)（圖4m,n）。

參考文章：

Pan Xiangyu,Wang Jian,Guo Linjie et al. Identifying a confused cell identity for esophageal squamous cell carcinoma.[J] .Signal Transduct Target Ther, 2022, 7: 122.