谷氨酸是脊椎動(dòng)物大腦中最豐富的神經(jīng)遞質(zhì)，每立方微米的神經(jīng)纖維網(wǎng)大約就有一個(gè)谷氨酸能突觸。盡管如此緊密的堆積，突觸谷氨酸信號(hào)傳導(dǎo)很少引起串?dāng)_。突觸通過離子型谷氨酸受體的動(dòng)力學(xué)和定位來實(shí)現(xiàn)這種空間特異性。

基于強(qiáng)度的谷氨酸感應(yīng)熒光報(bào)告（iGluSnFR）及其變體已被廣泛用于對(duì)突觸活動(dòng)進(jìn)行成像，包括自發(fā)和誘發(fā)的量子釋放（quantal release），以及突觸外信號(hào)。然而，現(xiàn)有的iGluSnFR變體在體內(nèi)具有低信噪比（SNR），限制了可以同時(shí)監(jiān)測(cè)的突觸數(shù)量。其次，iGluSnFR信號(hào)采集的空間范圍很大，因此，僅通過iGluSnFR測(cè)量，尚不清楚信號(hào)是來自突觸伴侶還是附近未連接的軸突。此外，實(shí)驗(yàn)還表明，iGluSnFR的膜顯示構(gòu)建體（PDGFR）對(duì)突觸后的納米定位較差；軸突上的信號(hào)大于樹突，與突觸后蛋白的融合增加了低親和力變體的信號(hào)。

基于以上局限性，近日，美國(guó)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所Kaspar Podgorski研究團(tuán)隊(duì)在Nature Methods發(fā)表研究，通過設(shè)計(jì)和優(yōu)化iGluSnFR變體，提高了突觸與突觸外谷氨酸信號(hào)的敏感性和特異性。

1、iGluSnFR3設(shè)計(jì)

研究人員在細(xì)菌、純化蛋白和培養(yǎng)神經(jīng)元中進(jìn)行20輪誘變和篩選，通過高通量分析來丟棄不需要的變體。通過測(cè)量親和力、pH響應(yīng)、量子產(chǎn)率、消光系數(shù)、2P光譜、熒光相關(guān)光譜（FCS）和停流動(dòng)力學(xué)。選擇了iGluSnFR3.v857（“v857”，與WT相比有15個(gè)突變），因?yàn)樗哂懈逰fast、快速的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、亮度、部分熒光響應(yīng)（ΔF/F0）和光穩(wěn)定性。同時(shí)也選擇了密切相關(guān)的變異體iGluSnFR3.v82進(jìn)行比較，它的動(dòng)力學(xué)特性不太利于突觸特異性。

通過實(shí)驗(yàn)比較，確定v857是一種敏感、選擇性的iGluSnFR變體，具有快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)和高Kfast。v82是一種敏感、選擇性的變體，與v857相比，它具有更高的親和力、更慢的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)和更低的Kfast：這些特性應(yīng)該使它對(duì)突觸外谷氨酸更敏感。

Figure 1 iGluSnFR3變體的光物理性質(zhì)

2、體外培養(yǎng)神經(jīng)元中突觸信號(hào)的成像

通過使用寬場(chǎng)成像監(jiān)測(cè)培養(yǎng)神經(jīng)元之間突觸處自發(fā)和誘發(fā)谷氨酸釋放的信號(hào)，來表征敏感性、空間特異性和飽和度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，v857能更線性地報(bào)告單個(gè)突觸的谷氨酸釋放，并更好地區(qū)分培養(yǎng)神經(jīng)元中的突觸和突觸外信號(hào)[Fig.2]。

Figure 2 成像和操縱突觸釋放

此外，研究人員還評(píng)估了這些功能改進(jìn)的構(gòu)建體的納米級(jí)定位。將編碼v857的Cre依賴性SGZ、GPI和PDGFR變體的腺相關(guān)病毒（AAV）注射到Emx1-Cre小鼠的皮層中。結(jié)果確定v857增加突觸信號(hào)SNR、改善培養(yǎng)神經(jīng)元的運(yùn)輸和改善iGluSnFR在體內(nèi)突觸后定位的基序。

Figure 3 膜靶向序列對(duì)突觸反應(yīng)和定位的影響

3、體內(nèi)iGluSnFR3成像和電生理學(xué)

接下來，研究人員對(duì)小鼠視覺皮層中的iGluSnFR3信號(hào)進(jìn)行了表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在注射編碼v857.GPI或v857.PDGFR變體的AAVs的小鼠中觀察到強(qiáng)信號(hào)，以及相對(duì)于WT增加的光穩(wěn)定性。電生理學(xué)確定表達(dá)v857的神經(jīng)元表現(xiàn)出更大、更快的單個(gè)AP相關(guān)瞬態(tài)[Fig.4]。

此外，使用iGluSnFR3的高信噪比和直接波前傳感自適應(yīng)光學(xué)2P（AO2P）顯微鏡克服了精確測(cè)量桶狀皮層L4的深度（約350–450?μm）和小突觸體積（<1?femtoliter）突觸活動(dòng)的挑戰(zhàn)。

Figure 4 視覺皮層的體內(nèi)成像和電生理

總結(jié)與展望

本研究通過在細(xì)菌、可溶性蛋白和培養(yǎng)的神經(jīng)元中進(jìn)行多途徑篩選，開發(fā)了具有改善的信噪比和動(dòng)力學(xué)的變體，改善了iGluSnFR在突觸后的納米定位。由此產(chǎn)生的指示劑iGluSnFR3表現(xiàn)出快速的非飽和激活動(dòng)力學(xué)。

iGluSnFR3提供了優(yōu)于先前方法的優(yōu)點(diǎn)。它的低動(dòng)力學(xué)飽和度使以前被飽和效應(yīng)混淆的定量測(cè)量變得更加容易。它的信噪比、動(dòng)力學(xué)和空間特異性允許從突觸群體中進(jìn)行記錄，同時(shí)解決單個(gè)輸入時(shí)間上的毫秒差異。這些能力將允許觀察神經(jīng)元計(jì)算和學(xué)習(xí)理論的突觸動(dòng)力學(xué)。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41592-023-01863-6

參考文獻(xiàn)

Aggarwal, Abhi et al. “Glutamate indicators with improved activation kinetics and localization for imaging synaptic transmission.” Nature methods, 10.1038/s41592-023-01863-6. 4 May. 2023, doi:10.1038/s41592-023-01863-6

編譯作者：Young（brainnews創(chuàng)作團(tuán)隊(duì)）

校審：Simon（brainnews編輯部）

標(biāo)簽：