實(shí)時(shí)定量PCR也被稱為實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)，是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，以熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量，進(jìn)而對(duì)待測(cè)樣品中的目的序列進(jìn)行定量分析的方法。

基本原理

在學(xué)習(xí)實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)處理之前，我們首先需要了解一下它的數(shù)學(xué)原理，Ct值為什么是我們數(shù)據(jù)處理過程中的一個(gè)關(guān)鍵的因素。這兩個(gè)圖顯示的是實(shí)時(shí)定量PCR的一組結(jié)果。上圖是原始的線性圖譜，下圖則是處理過的指數(shù)圖譜，但是它們兩者表示的是同樣的意思。x-軸表示PCR 循環(huán)數(shù)，y-軸表示擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值，也就是擴(kuò)增產(chǎn)物的量。這個(gè)圖中有基線、閾值、Ct值這幾個(gè)概念，從這幾個(gè)值我們能夠最終得到模板中目的基因的含量。

（1）那么什么是基線？如紅色框所指，基線就是擴(kuò)增曲線中的水平部分。在反應(yīng)最初階段，雖然產(chǎn)物是指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，但是由于總量太少，其熒光處于背景水平，檢測(cè)不到熒光增加。因此基線信號(hào)的產(chǎn)生是由于測(cè)量的偶然誤差引起的。然而當(dāng)累積了足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物，足以產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)時(shí)，這個(gè)信號(hào)的值就被稱為閾值，如紅色箭頭所指。通常閾值默認(rèn)為基線信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差×10。在閾值的前后，PCR的反應(yīng)仍然是指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的，因此此時(shí)的PCR結(jié)果可靠，可以準(zhǔn)確地反映體系中模板的初始量。Ct值是信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)，也就是擴(kuò)增曲線與閾值的交叉點(diǎn)，如圖中的紅點(diǎn)所指。

（2）我們可以看到圖的右邊顯示了擴(kuò)增曲線的4個(gè)階段：基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。其中在基線期和指數(shù)增長(zhǎng)期，擴(kuò)增產(chǎn)物都是以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的，但是在基線期我們沒有辦法檢測(cè)；而到了線性期和平臺(tái)期之后，由于不同基因，或者不同條件下其擴(kuò)增效率差別很大，因此沒有辦法計(jì)算模板的含量。因此，在指數(shù)增長(zhǎng)期的Ct值就成為了計(jì)算模板含量的一個(gè)關(guān)鍵值。

（3）那么，為什么知道了Ct值就能夠得到最初的目的基因含量呢？圖中表示一個(gè)基因的單次反應(yīng)擴(kuò)增曲線。上面這個(gè)公式計(jì)算的是擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)N，它等于模板的分子數(shù)乘以1+擴(kuò)增效率的n次方，n代表循環(huán)次數(shù)。也就是說，如果擴(kuò)增效率為100%，產(chǎn)物分子數(shù)就等于模板數(shù)乘以2的n次方。但是顯然，在線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期，擴(kuò)增效率不可能是100%，因此上述PCR理論方程只在指數(shù)期成立，也就是綠色框的部分。

數(shù)據(jù)處理

1、這里的三張圖片分別展示了我們?cè)谧鰺晒舛縋CR時(shí)提到的三個(gè)名稱：擴(kuò)增曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線，熔解曲線。

（1）擴(kuò)增曲線：擴(kuò)增曲線有兩種展現(xiàn)形式，一種是線性，一種是對(duì)數(shù)形式。我們通常是用CT 來推算樣品中樣品的濃度。CT 值越高說明模板濃度越低。上面也詳細(xì)說明了原理，在這里就不過多贅述。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線：將已知濃度的樣品（標(biāo)準(zhǔn)品）經(jīng)過梯度稀釋后分別取樣進(jìn)行熒光定量PCR，得到的一系列的Ct值，用這個(gè)Ct值與Log模板數(shù)對(duì)應(yīng)可以得到一個(gè)相關(guān)的曲線，我們叫標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢杂眠@個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的一些參數(shù)來判斷這個(gè)熒光定量PCR體系的優(yōu)劣。

（3）熔解曲線：Tm值，Melting Temperature（解鏈溫度），PCR雙鏈產(chǎn)物的退火溫度。這兩個(gè)圖是在熒光定量PCR結(jié)束后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行逐步升溫時(shí)進(jìn)行的監(jiān)測(cè)，可以看到在達(dá)到其解鏈溫度時(shí)，熒光信號(hào)會(huì)有一個(gè)忽然的下降。我們將測(cè)得的這個(gè)曲線叫做熔解曲線。理論上如果PCR得到特異性產(chǎn)物則只有一個(gè)Tm值，在溶解曲線上表示只有單峰存在。如果是多相峰，那么可以判斷產(chǎn)物不是單一的，發(fā)生了非特異擴(kuò)增。

2、絕對(duì)定量：用于確定未知樣本中某個(gè)核酸序列的絕對(duì)量值，即通常所說的拷貝數(shù)。絕對(duì)定量需要已知濃度的模板來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。絕對(duì)定量在我們的實(shí)驗(yàn)中不常用，所以只簡(jiǎn)單介紹一下。是通過樣品的CT 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較實(shí)現(xiàn)的。分析的結(jié)果是給定數(shù)量的樣品中（給定數(shù)量的細(xì)胞，每微克總RNA）中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）。

3、相對(duì)定量：是用來確定經(jīng)過不同處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)相的表達(dá)差異，也就是倍數(shù)差異。

以上圖為例，分析結(jié)果是在試驗(yàn)組和對(duì)照組中某一個(gè)靶基因的相對(duì)比率，即倍數(shù)差異。

進(jìn)行相對(duì)定量可以以質(zhì)量單位或者是參照基因作為標(biāo)準(zhǔn)，但是以參照基因作為標(biāo)準(zhǔn)的做法更加普遍，也更加方便，因此只介紹后者。用參照基因的優(yōu)點(diǎn)是，這個(gè)方法能準(zhǔn)確量化模板中的靶基因含量，尤其是當(dāng)模板難以獲得時(shí)，進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)十分方便。但前提是我們必須要找到在不同狀態(tài)中恒定表達(dá)的基因，而且它的表達(dá)水平不受樣品處理方式的影響，比如熱刺激，菌誘導(dǎo)等。