背景

膀胱癌（Bladder cancer，BLCA）是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的癌癥之一，也是全球第十大常見癌癥，每年約有549，000例新發(fā)病例及約200，000例死亡病例。其中75%的病例被診斷為非肌肉浸潤性膀胱癌（NMIBC），其余25%的病例為肌肉浸潤性膀胱癌（MIBC），而這兩種腫瘤的治療方法是完全不一樣的。因此，在確定治療方案前，對膀胱癌進行準確分類十分重要。膀胱癌的臨床治療方案的選擇依賴于腫瘤分期的準確判定，分期不準確會引入不必要的手術治療、降低治療后的生存率，也可能永久性降低患者生活質量。而傳統(tǒng)的膀胱癌(BLCA)無創(chuàng)診斷方法敏感性低、特異性低，難以檢測早期腫瘤、微小腫瘤、腫瘤殘留灶及復發(fā)腫瘤，也無法準確區(qū)分高級別(HG)和低級別(LG)腫瘤、區(qū)分肌肉浸潤性膀胱癌（MIBC）和非肌肉浸潤性膀胱癌（NMIBC）。

為此，武漢大學中南醫(yī)院的Wang等人對膀胱癌的整個DNA甲基化（DNAm）的綜合表征進行研究。他們發(fā)現(xiàn)DNA甲基化是泛癌癥特異性標志物的一種，特殊DNA甲基化的檢測可用于癌癥確診及亞型精準分類。故對不同腫瘤組織和常規(guī)尿液進行全基因組靶向測序，最終發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤DNA甲基化（ctDNAm）的靶向測序可以幫助我們準確區(qū)分HG腫瘤和LG腫瘤、區(qū)分MIBC和NMIBC，且在復發(fā)預測、預后預測方面較基因組突變及熒光原位雜交檢測（FISH）更優(yōu)異，并發(fā)表了題為“Non-invasive diagnosis and surveillance of bladder cancer with driver and passenger DNA methylation in a prospective cohort study”的文章。下面就帶大家了解具體研究過程。

相關基因的T1DMR/T2DMR DNA甲基化與BLCA發(fā)生密切相關

? ? ? ??通過統(tǒng)計學比較不同組織來源的DNAm譜可以得到每個組別的甲基化差異區(qū)域（DMR）（見圖1 A），研究人員從中選取了T1DMR（癌變前正常細胞甲基化差異區(qū)域）及T2DMR（癌變細胞的甲基化差異區(qū)域）進行研究。

單個DNA上多個CpG位點發(fā)生胞嘧啶甲基化的情況被稱之為甲基化單倍型。在癌癥腫瘤發(fā)生過程中，T1DMR的甲基化單倍型不會發(fā)生變化，也不具備致癌能力，而T2DMR的甲基化單倍型會有所變化，且與癌癥進程驅動及腫瘤惡化有著密切聯(lián)系。因此，研究人員將T1DMR稱為passenger位點、將T2DMR稱為driver位點，并對與膀胱癌有關的17個T1DMR、T2DMR進行了單細胞RNA和ATAC測序。結果表明，LG腫瘤、NMIBC僅與T1DMR的單倍型有關，HG腫瘤及MIBC則與T2DMR單倍型有關（見圖1 C）。而對不同腫瘤分類的患者樣品單倍型進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)T2DMR組中的HOXC9、CCN1、MYOM2、SOX2基因甲基化與HG腫瘤發(fā)生有著較強關聯(lián)（見圖1 D），HG腫瘤的單倍型多樣性較LG高，且HG和LG腫瘤中的T1DMR單倍型并不相同，提示HG腫瘤中存在明顯的表觀遺傳重排現(xiàn)象，HG/MIBC和LG/NMIBC來源于不同細胞。

構建SOX2相關T2DMR敲除細胞驗證T2DMR在BLCA的作用

上述實驗確認了MIBC和NMIBC起源于不同細胞的分化，研究人員對MIBC、NMIBC的細胞（即尿路上皮基底細胞和尿路上皮中層細胞）的SOX2位點相關驅動基因的T2DMR功能進行了驗證。

通過ATAC數(shù)據(jù)庫確定SOX2位點附近的調控元件及其染色體可及性，對膀胱癌細胞系T24（來自MIBC供體）、5637（來自MIBC供體）、RT4（來自NMIBC腫瘤）進行CUT&Tag實驗，研究轉錄因子和染色質調控因子與SOX2區(qū)域的結合。實驗結果表明基底細胞特有的FOXA1與遠端調控區(qū)（L1或L4）的結合會抑制SOX2和L4的非增強子依賴順式相互作用，并激活L1增強子的活性，促進L1與SOX2的相互作用（見圖2）。

對此，研究人員先使用Cas9慢病毒（由源井生物提供）構建5637-Cas9, RT4-Cas9和T24-Cas9穩(wěn)轉株，然后轉導DMR或?SOX2的KO?sgRNA慢病毒（由源井生物提供），對上述TM4SF1癌癥陽性亞群（TPCS）細胞系的SOX2相關T2DMR區(qū)域、SOX2位點進行敲除以研究T2DMR對SOX2表達的調控作用。結果顯示，敲除SOX2-T2DMR后，SOX2無法與L1增強子進行相互作用，導致SOX2 RNA表達下降（見圖2 C）。而直接敲除SOX2會減弱TPSC細胞系的遷移、侵襲能力（見圖?3），對MIBC的侵襲性有重大影響。這些結果都表明T2DMR是膀胱癌SOX2的重要調控元件，其差異性甲基化會驅動癌癥從NMIBC向MIBC轉變，提示T2DMR甲基化差異或能成為MIBC與NMIBC分類依據(jù)。

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測試T1DMR和T2DMR的DNA甲基化是否可作為BLCA精準分類依據(jù)

???采用EUCAS法對MIBC、NMIBC組織進行測序，并根據(jù)流行率繪制T1DMR、T2DMR DNAm單倍型熱圖（見圖4 A）。熱圖顯示，DMR單倍型的流行率可以將BLCA樣品進行清晰的HG/LG分類，且HG組中不僅有致癌基因突變還有抑癌基因突變（TP53、CDKN、SOX），而LG組中僅有致癌基因突變（見圖4 A）。構建模型進行預測發(fā)現(xiàn)T1DMR和T2DMR的DNA甲基化檢測可以準確反映腫瘤生物學潛在病理、臨床特征，用于MIBC、NMIBC的精確分類（見圖4B）。

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尿液中T1DMR/T2DMR相關甲基化檢測用于BLCA分類/復發(fā)/預后預測的可行性

隨后作者對是否可以在尿液中識別癌癥相關甲基化特征進行了驗證，發(fā)現(xiàn)腫瘤載量與尿液中的DNAm信號呈正相關，并開發(fā)了一種BLCA無創(chuàng)檢測方法——通過對尿液樣品中DNAm單倍型進行多重PCR NGS測序以便予腫瘤進行預測評分（UCAS）。作者對該方法與傳統(tǒng)BLCA無創(chuàng)檢測方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)這種新方法有著更高的敏感性及特異性，要優(yōu)于現(xiàn)有的臨床檢測方法。

不僅如此，作者還通過對比術前術后臨床病理結果及UCAS檢測結果證實了UCAS對HG/LG、MIBC/NMIBC分類預測的準確性，及UCAS用于術后殘留灶檢測及復發(fā)預測的可行性與準確性。

該研究確定了腫瘤特異性DMR上的DNA甲基化作為膀胱癌無創(chuàng)檢測、監(jiān)測的生物標志物的效用，開創(chuàng)了一種分類更為準確的膀胱癌無創(chuàng)檢測方法，有望為膀胱癌臨床治療提供更便捷、更精準的腫瘤分期判斷，為膀胱癌治療預后提供保障！

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參考文獻：

Xiao, Yu et al. “Non-invasive diagnosis and surveillance of bladder cancer with driver and passenger DNA methylation in a prospective cohort study.”?Clinical and translational medicine?vol. 12,8 (2022): e1008. doi:10.1002/ctm2.1008