來源：“藥物微生物檢驗”公眾號
原標(biāo)題：《微生物常見檢測方法大全》

微生物的檢測，無論在理論研究還是在生產(chǎn)實踐中都具有重要的意義。常見的檢測方法有：生長量測定法、微生物計數(shù)法、生理指標(biāo)法和商業(yè)化快速微生物檢測等，本文主要介紹常用的檢測方法的的原理，應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點。

微生物生長意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù)，而測定繁殖則都要建立在計數(shù)這一基礎(chǔ)上。微生物生長的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標(biāo)來進(jìn)行衡量。

生長量測定法

1、體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

原理：通過測定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。

菌絲濃度測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個重要監(jiān)測指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設(shè)定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物，結(jié)果會有一定偏差。

2、稱干重法：

原理：利用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10-20%。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母（activity ?dry ?yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。

3、比濁法：

原理：微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測。

4、菌絲長度測量法：

方法：對于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測定一定時間內(nèi)菌絲生長的長度

微生物計數(shù)法

1、血球計數(shù)板法:

這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。

2、染色計數(shù)法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數(shù)，而直接用血球計數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計數(shù)法。

3、比例計數(shù)法：

將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。

4、液體稀釋法：

對未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計數(shù)，從最適宜的三個連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查最大或然數(shù)表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

5、平板菌落計數(shù)法：

這是一種最常用的活菌計數(shù)法。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。

6、試劑紙法：

在平板計數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計數(shù)用。試劑紙法計數(shù)快捷準(zhǔn)確，相比而言避免了平板計數(shù)法的人為操作誤差。

7、膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會發(fā)橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。

生理指標(biāo)法

微生物的生長伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長量相平行的生理指標(biāo)很多，它們可作為生長測定的相對值。

1、測定含氮量：

大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測氮氣法。

2、測定含碳量：

將少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3、還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的常規(guī)監(jiān)測。

4、氨基氮的測定：

方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)數(shù)刻，加入0.02N的使之變色，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

5、其他生理物質(zhì)的測定：

P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2（用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)），耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標(biāo)， 都可用于生長量的測定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，最終產(chǎn)氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。

商業(yè)化快速微生物檢測法

微生物的檢測，其發(fā)展方向是快速，準(zhǔn)確，簡便，自動化，當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測原理，結(jié)合不同的檢測方法，設(shè)計了形式各異的微生物檢測儀器設(shè)備，正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測和科學(xué)研究領(lǐng)域。例如：
??????1、抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測技術(shù)
??????2、BACTOMETER 全自動各類總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測系統(tǒng)

這些儀器和設(shè)備的生產(chǎn)廠家很多，產(chǎn)品各異，在此不做一一介紹，具體可查看各公司的產(chǎn)品說明。

在微生物檢驗操作過程中，要保證檢測環(huán)境(如超凈臺、檢測室)以及所用工器具的潔凈程度，同時保證人員各種操作的規(guī)范性，盡量保證其無菌性，防止因人為原因操作失誤而出現(xiàn)誤差結(jié)果，同時在適宜溫度進(jìn)行培養(yǎng)，為合理決策和指導(dǎo)生產(chǎn)提供依據(jù)。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們應(yīng)做好以下幾個方面。

培養(yǎng)基的滅菌及使用

1.每次配制時，要注意其生產(chǎn)日期是否在保質(zhì)期內(nèi)，查看其開瓶日期及瓶口密封性，保證其未變質(zhì)，并且未吸潮。

2.培養(yǎng)基配制時，稱量要準(zhǔn)確，包括鹽水的分裝要準(zhǔn)確。

3.一定要保證現(xiàn)配制現(xiàn)滅菌，未滅菌的配好培養(yǎng)基不能長時間放置，更不可隔夜。

4.滅菌時要保證恒溫、恒壓，同時要保證有效的滅菌時間。

5.滅菌過的培養(yǎng)基要冰箱保存，可保存一周，一般不超過 3 天。而且要遵循“先入先出”原則，先配制的要先使用。

6.在使用時，要根據(jù)當(dāng)班次的使用量，用水浴鍋先將培養(yǎng)基溶化為液態(tài)，然后及時調(diào)低水浴溫度（先化好的可從水浴取出，放在水浴鍋鍋蓋上）待用，千萬不可長時間使培養(yǎng)基處于高溫狀態(tài)。

7.做產(chǎn)品微生物檢測時，傾倒培養(yǎng)基溫度在 45℃左右，不可過燙，避免將菌燙死；也不可過涼，化好的培養(yǎng)基又結(jié)塊凝固，不便于觀察結(jié)果。

8.每瓶培養(yǎng)基均要做空白。

9.盡量集中做樣，避免頻繁打開同一瓶培養(yǎng)基瓶塞，增大培養(yǎng)基的污染幾率，出現(xiàn)誤差結(jié)果。

10.培養(yǎng)基剩余過少時，可先將其傾倒成空白用板。

檢測環(huán)境的維持

1、大環(huán)境（檢測室）

（1）檢測時，窗戶和空調(diào)要關(guān)閉，或用酒精對房間進(jìn)行噴霧消毒，避免房間內(nèi)空氣流通影響超凈臺內(nèi)部環(huán)境（最好在有通排風(fēng)系統(tǒng)的恒溫恒濕無菌間進(jìn)行操作）。

（2）如果在原來的原料微生物檢測室進(jìn)行檢測，要定期開啟紫外燈，對房間進(jìn)行殺菌。

2、小環(huán)境（超凈工作臺）

1.定期清潔初效過濾器，要及時更換。

2.檢測前，將超凈臺內(nèi)部進(jìn)行清潔，用 75%酒精進(jìn)行擦拭消毒，并提前半小時將超凈臺紫外燈打開，對超凈臺內(nèi)部環(huán)境進(jìn)行殺菌。?

3.關(guān)紫外燈，開風(fēng)機，調(diào)整合適進(jìn)風(fēng)量，風(fēng)量不可過低。

4.每次檢測后，要對超凈臺內(nèi)部進(jìn)行清理、清潔，并用 75%酒精進(jìn)行擦拭消毒。

5.紫外燈根據(jù)其使用壽命要及時更換。

6.檢測同時，要做上相應(yīng)菌落檢測的環(huán)境空白。

7.檢測區(qū)域的選擇：
??????a、一般在距離超凈臺外沿的 1/3-2/3 區(qū)域進(jìn)行無菌操作；
??????b、要在酒精燈火焰的外焰保護區(qū)域進(jìn)行操作。

工器具的潔凈度

1.玻璃器皿：采用干熱滅菌方式進(jìn)行滅菌。?

2.檢測用剪刀、勺子等物品要做到檢測專用，不可與其它操作器具混用，使用時，先用75%酒精消毒，再采用灼燒方式進(jìn)行滅菌。?

3.接種針（環(huán)）采用灼燒方式進(jìn)行滅菌，但要注意檢測時要先將接種針（環(huán)）進(jìn)行冷卻。

樣品的采集及檢測

1、保證采樣器具的無菌性
???（1）玻璃器皿：采用干熱滅菌方式進(jìn)行滅菌，保證恒溫、時間足夠（但不可時間過長，容易導(dǎo)致玻璃器皿易裂紋而報廢）。?
???（2）取樣筐：使用前要用75%酒精進(jìn)行噴灑消毒。?
???（3）取樣勺：要保證其清潔消毒，清潔后用75%酒精進(jìn)行擦拭消毒。?
???（4）取樣袋：可先用酒精進(jìn)行擦拭消毒，再在超凈臺用紫外燈照射消毒，（包裝車間要在傳遞窗用紫外燈照射消毒）。?
???（5）電子稱表面用 75%酒精消毒。

2、人員操作
???（1）保證手部的清洗、消毒：取樣前及檢測前都要先洗手再消毒。
???（2）取樣要具有代表性（隨機樣、目的樣、綜合樣）且要標(biāo)示清楚。
???（3）取樣完畢，不可在車間逗留，要及時將樣品放入超凈臺，對其外表面進(jìn)行紫外燈照射消毒。
???（4）在要求的檢測區(qū)域進(jìn)行操作。
???（5）檢測前，要用 75%酒精棉球?qū)悠反诓窟M(jìn)行擦拭消毒，再開口。
???（6）往鹽水瓶加樣品時，要注意勺子或袋子盡量不接觸瓶口。
???（7）樣品計量要準(zhǔn)確，稀釋倍數(shù)也要準(zhǔn)確（1mL 吸管不允許將管口敲掉），進(jìn)行 100 倍稀釋時，1mL 吸管要伸入鹽水中，不可以將樣品從管壁流下去，同時要避免將管底部捅破。
???（8）鹽水溫度以 40℃左右為宜，不能過熱，會將部分微生物燙死；也不能溫度太低，不能將樣品溶解完全。
???（9）進(jìn)行稀釋時，要搖勻，保證溶液的均一性。
???（10）傾倒平皿時，要注意培養(yǎng)基瓶口不要接觸到平皿；傾倒的培養(yǎng)基要適量，不可以太少，在培養(yǎng)過程中易干掉，微生物亦死亡，以 15mL 左右為宜。
???（11）做大腸菌群樣時，要提前將乳糖膽鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)管按需要量備好，放入超凈臺對外表面進(jìn)行紫外線滅菌。
???（12）接二步時，要注意先將接種針（環(huán)）進(jìn)行冷卻，避免出現(xiàn)接不上菌落的情況，導(dǎo)致無法判斷、確認(rèn)。
???（13）檢測完畢，及時放入相應(yīng)培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，并清理清潔超凈臺。

微生物的培養(yǎng)

1.在培養(yǎng)過程中，要隨時監(jiān)控培養(yǎng)箱溫度，保證其在適宜的溫度進(jìn)行培養(yǎng)。

2.要按照《微生物檢驗規(guī)范》要求及時觀察結(jié)果，出現(xiàn)異常，要及時分析原因進(jìn)行反饋。

思考與討論

微生物的生長不同于其他生物的生長，微生物的個體生長在科研上有一定困難，通常情況下也沒有實際意義。微生物是以量取勝的，因此，微生物的生長通常指群體的擴增。

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