細(xì)胞蛋白提取

①不同處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，以6孔板為例，棄去培養(yǎng)基，向每孔加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液2?ml，輕輕晃動(dòng)6孔板使細(xì)胞充分洗滌，棄去磷酸鹽緩沖液。該操作重復(fù)3次。吸凈殘留的磷酸鹽緩沖液，避免蛋白裂解液被稀釋。

②根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，按照蛋白裂解液RIPA：A液：B液：C液：P液＝100∶1∶1∶2∶1的比例配制蛋白質(zhì)裂解液。以6孔板為例，向每孔中加入100 ul蛋白質(zhì)裂解液，在4℃實(shí)驗(yàn)室中放置在搖床上均勻搖晃5?min。

③根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，一個(gè)孔至少準(zhǔn)備一個(gè)細(xì)胞刮，預(yù)先清洗細(xì)胞刮，并且放入高溫烤箱中烘干，待細(xì)胞刮上的液體烘干后，將細(xì)胞刮取出，放入4℃冰箱冷卻。將預(yù)冷的細(xì)胞刮取出，用力均勻地使用刮板，將細(xì)胞刮下，每個(gè)角落都要刮到，一個(gè)孔刮2?min。用無(wú)酶無(wú)菌槍頭將蛋白裂解液全部轉(zhuǎn)移到1.5 ml無(wú)酶EP管中，注意不要?dú)埩粢后w，盡可能將蛋白裂解液全部轉(zhuǎn)移。該操作全部于冰上進(jìn)行，注意低溫，以免影響蛋白質(zhì)提取質(zhì)量。

④用50?ml離心管準(zhǔn)備一管預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，用于超聲過(guò)程中超聲波細(xì)胞破碎儀的清洗。打開(kāi)超聲波細(xì)胞破碎儀，調(diào)至2檔，將超聲波探頭放入磷酸鹽緩沖液中，打開(kāi)3秒，清洗超聲波探頭，將探頭移出，用干凈紙巾擦干上面殘留的磷酸鹽緩沖液。將超聲波探頭伸入EP管中，注意不要碰到管壁和底部，打開(kāi)超聲儀3秒，關(guān)閉后抖動(dòng)超聲波探頭，將殘留的蛋白質(zhì)裂解液甩下。將超聲波探頭伸入磷酸鹽緩沖液中，打開(kāi)3秒，清洗，將探頭移出并擦干。該操作重復(fù)3次，且同一管蛋白樣品重復(fù)超聲的時(shí)間間隔為5?min。

⑤將離心機(jī)調(diào)至4℃預(yù)冷，4℃下12?000 rpm/min離心20 min。

⑥動(dòng)作輕柔地將EP管從離心機(jī)中取出，可見(jiàn)蛋白質(zhì)裂解液上清液和底部沉淀。將上清液全部轉(zhuǎn)移至新的蛋白管中，移液時(shí)大致判斷蛋白上清液的量，注意不要吸到管子底部的細(xì)胞碎片沉淀。按照蛋白裂解液∶5×SDS-Page蛋白上樣緩沖液＝4∶1的比例，因?yàn)樵噭┱吵?，在加樣前要震蕩離心，便于加樣。再加入蛋白上樣緩沖液，震蕩混勻，瞬時(shí)離心，使溶液充分混勻混合。在蛋白管上標(biāo)注實(shí)驗(yàn)人員姓名、提取蛋白日期、細(xì)胞種類(lèi)、蛋白管編號(hào)等基本信息。

⑦將蛋白管裝在浮標(biāo)上，預(yù)先在水浴鍋中將水加熱至沸騰，再將裝有蛋白管的浮標(biāo)扔進(jìn)水浴鍋中加熱，沸水加熱20?min。如果需要后續(xù)進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)，則可進(jìn)行。如果暫不需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則將蛋白管放于﹣80℃冰箱進(jìn)行儲(chǔ)存。

Western Blot

1）電泳

①用純水將玻璃板清洗之后晾干，注意沒(méi)有膠絲殘留在玻璃板上，將玻璃板放在膠架上夾緊，注意短板在外，長(zhǎng)板在內(nèi)，安裝好后，在膠板內(nèi)加入純水，靜置10 min，檢查是否有水滲漏。如果不漏，則可進(jìn)行下一步制膠。如果滲漏，則重新調(diào)整玻璃板，重新檢漏。

②使用Yeasen公司的免封閉PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）進(jìn)行制膠。試劑預(yù)先放入4℃冰箱中進(jìn)行保存，不可在常溫下放置。以一塊1.0 mm膠為例，取2.7 ml的分離膠緩沖液和2.7 ml的分離膠溶液混勻，該過(guò)程要操作迅速，并且前期的試管和滴管都必須干凈，無(wú)液體殘留，以免稀釋分離膠。再加入45 ul改良型過(guò)硫酸銨溶液，此時(shí)分離膠容易迅速凝固，充分混勻。在加入所有液體混勻后迅速將分離膠混合液加入制膠玻璃板中。再加入3 ml無(wú)水乙醇進(jìn)行液封，靜置20 min。留少許分離膠混合液在離心管中，觀察有無(wú)凝固。

③在光下觀察制膠玻璃板，出現(xiàn)明顯的折光線和分層，且離心管中分離膠混合液凝固，則將無(wú)水乙醇倒掉，用干凈濾紙吸凈殘留無(wú)水乙醇，靜置5 min等無(wú)水乙醇揮發(fā)。此時(shí)可配制濃縮膠混合液。取0.75 ml濃縮膠緩沖液和0.75 ml濃縮膠溶液混勻，再加入13 ul改良型過(guò)硫酸銨溶液，充分混勻。在加入所有液體混勻后迅速將濃縮膠混合液加入制膠玻璃板中。再輕輕插入梳齒，并在梳齒兩側(cè)補(bǔ)適量濃縮膠混合液，靜置20 min。留少許濃縮膠混合液在離心管中，觀察有無(wú)凝固。

④離心管中濃縮膠混合液凝固后，輕輕拔去梳齒。將蛋白樣品放在冰上解凍。配制電泳液，并將新鮮電泳液倒入電泳槽中。將制膠玻璃板放入電泳槽中夾緊，使電泳液沒(méi)過(guò)制膠玻璃板的上樣孔。蛋白樣品解凍后瞬時(shí)離心，上樣前震蕩，槍頭伸進(jìn)前1/3，注意不要戳穿上樣孔。如果上樣孔有膠絲堵住，則用針頭挑開(kāi)即可。加樣時(shí)速度先稍慢，確定樣品進(jìn)入上樣孔中后稍快地加樣。注意樣品的兩邊可加入不同量的蛋白marker，便于分清左右。

⑤紅色電線對(duì)紅色插頭，黑色線對(duì)黑色插頭，連接好后打開(kāi)電源，可見(jiàn)氣泡向上走。調(diào)節(jié)電壓為70 V，約20 min后可見(jiàn)濃縮膠的蛋白marker分開(kāi)，當(dāng)樣品蛋白被壓成一條直線后，調(diào)成120 V~130 V，電泳30?min~40 min。最終電泳時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行自行調(diào)整。

2)?轉(zhuǎn)膜

①電泳時(shí)可準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜使用工具。配制新鮮轉(zhuǎn)膜液，由于甲醇易揮發(fā)，可以先不加甲醇，等最后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜時(shí)加入甲醇。電泳完畢后將玻璃板從電泳儀中取出，用清水沖洗后，將玻璃板放進(jìn)潤(rùn)膜液中，防止干燥造成膠破裂。左手托著玻璃板，右手輕輕地將翹板器插入短板和長(zhǎng)板之間，切勿用蠻力，小心輕柔地將膠翹到短板上。在翹板過(guò)程中要保持翹板器和玻璃板的濕潤(rùn)，否則膠十分容易在此過(guò)程中破裂。若一次性轉(zhuǎn)多塊膠，其余玻璃板應(yīng)放在潤(rùn)膜液中，保持濕潤(rùn)狀態(tài)。如果沒(méi)有翹板器，可以在潤(rùn)膜液中進(jìn)行翹板。

②根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將所需要的蛋白分子量所在的位置剪切下來(lái)，上下至少留2個(gè)可辨認(rèn)且清晰的蛋白marker，便于識(shí)別。用直尺比照膠的長(zhǎng)度和寬度，脫下接觸轉(zhuǎn)膜液的外手套，換上干凈的PE手套，根據(jù)膠的尺寸進(jìn)行剪PVDF膜。注意在剪膜時(shí)一定不能污染PVDF膜，即使戴了PE手套也不直接接觸PVDF膜，避免造成污染。將剪好的PVDF膜放在裝有甲醇的盒子內(nèi)激活2?min。

③將方格紙墊在干凈PVDF膜下，用圓珠筆在PVDF的非蛋白面做好標(biāo)記。將膠放在轉(zhuǎn)膜夾棉墊的正中央偏上，一邊滴加轉(zhuǎn)膜液至膜上，保持膜表面濕潤(rùn)，一邊將PVDF膜小心地覆蓋在膠上。一邊向PVDF膜上滴加轉(zhuǎn)膜液，一邊檢查PVDF膜和膠之間有無(wú)小氣泡，如果有小氣泡，向氣泡處滴加轉(zhuǎn)膜液，將氣泡擠出去。向膜和膠上滴加甲醇，提高轉(zhuǎn)膜效率。確認(rèn)無(wú)氣泡殘留之后，將濾紙一層層蓋在PVDF膜上，注意不要有氣泡，如果有氣泡的話就滴加轉(zhuǎn)膜液將氣泡趕出去。將轉(zhuǎn)膜夾合上后，切勿再移動(dòng)轉(zhuǎn)膜夾，扣緊轉(zhuǎn)膜夾，以免PVDF膜和膠之間位置移動(dòng)并產(chǎn)生氣泡，降低轉(zhuǎn)膜效率。

④將轉(zhuǎn)膜夾放進(jìn)轉(zhuǎn)膜槽中，注意轉(zhuǎn)膜夾白色面對(duì)轉(zhuǎn)膜槽紅色面，黑色面與轉(zhuǎn)膜槽黑色相對(duì)，在轉(zhuǎn)膜槽的空處放入兩個(gè)冰盒，倒入新鮮配制的轉(zhuǎn)膜液，沒(méi)過(guò)轉(zhuǎn)膜夾。接上電源，注意紅色的電線接紅色的電極，并且觀察電極上有無(wú)膠絲液體殘留，以免損耗電極，黑色的電線接黑色的電極，將電流調(diào)至220 mA，查看電壓，電壓應(yīng)<120 V，在轉(zhuǎn)膜槽周?chē)胖米懔康谋捅?，由于轉(zhuǎn)膜過(guò)程中會(huì)散熱，每隔30 min可以查看一次電流、電壓，避免轉(zhuǎn)膜過(guò)程中溫度過(guò)高影響轉(zhuǎn)膜效應(yīng)，轉(zhuǎn)膜2小時(shí)。

3)?免疫學(xué)檢測(cè)

①轉(zhuǎn)膜完畢后，將轉(zhuǎn)膜夾取下，可見(jiàn)PVDF膜上顯示DNA marker，而膠上無(wú)DNA marker殘留。將PVDF膜蛋白面朝上放入盒中，倒入適量TBST溶液，放在TBST溶液中清洗15 min，棄去TBST溶液。該操作重復(fù)3次。

②將PVDF膜轉(zhuǎn)移至平皿中，向皿中加入8?ml封閉液，蛋白面朝上，與封閉液充分接觸，封閉液需充分沒(méi)過(guò)PVDF膜。室溫下?lián)u床2小時(shí)。該操作為降低非特異性結(jié)合，讓封閉液中的大分子物質(zhì)封閉無(wú)關(guān)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。

③封閉完成后，棄去封閉液。將PVDF膜蛋白面朝上放入盒中，放在TBST溶液中清洗15 min，棄去TBST溶液。該操作重復(fù)3次。將PVDF膜轉(zhuǎn)移至平皿中，向皿中加入8?ml配置好的一抗溶液，4℃下?lián)u床15小時(shí)。如果一抗結(jié)合的效率較低或較高，可以根據(jù)時(shí)間適當(dāng)調(diào)整一抗孵育時(shí)間。

④孵育一抗完成后，將一抗溶液回收。將PVDF膜蛋白面朝上放入盒中，放在TBST溶液中清洗15 min，棄去TBST溶液。該操作重復(fù)3次。將PVDF膜轉(zhuǎn)移至平皿中，向皿中加入8 ml配置好的二抗溶液，4℃下?lián)u床2小時(shí)。

⑤孵育二抗完成后，將二抗溶液回收。將PVDF膜蛋白面朝上放入盒中，放在TBST溶液中清洗15 min，棄去TBST溶液。該操作重復(fù)3次。按照顯影液∶定影液＝1∶1的比例配制化學(xué)熒光發(fā)光液，現(xiàn)配現(xiàn)用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，2個(gè)DNA marker之間需要200 uL化學(xué)熒光發(fā)光液。用鑷子夾著PVDF膜的邊緣，將PVDF膜從取出，在干凈濾紙上小心濾干水液，注意不要污染蛋白面。將蛋白面朝下放在干凈且無(wú)水的皿中，將化學(xué)熒光發(fā)光液滴在條帶四周，用鑷子夾著膜的邊緣，輕輕晃動(dòng)，使蛋白面與發(fā)光液充分接觸，再將膜翻轉(zhuǎn)，蛋白面朝上，大分子量DNA maker在上，小分子量DNA marker在下，放入曝光儀中。

⑥調(diào)整條帶位置，讓條帶處于曝光儀中央。選擇合適的曝光時(shí)間，進(jìn)行曝光，以蛋白條帶在過(guò)曝前顯色最深為宜，保存圖片，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

該實(shí)驗(yàn)操作步驟解說(shuō)僅供參考。本人保留一切權(quán)利。