【原創(chuàng)】基因測序的故事
前基因測序時代
基因是具有遺傳效應的DNA片段。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?——《高中生物必修二》
第一章 豌豆花園里的探險：基因的發(fā)現(xiàn)
自古以來，人們就認識到，貓只能生出貓，狗只能生出狗，”龍生龍，鳳生鳳，老鼠的兒子會打洞”。進入封建時代以來，社會的關系也是根據(jù)血緣而構建的。劉玄德乃是中山靖王之后，達延汗乃是成吉思汗之后，而北歐瑞典人，連名字里都要加上一個”松”字來表達誰是誰的后代。毫無疑問，全世界的古人都對遺傳現(xiàn)象視之甚重。
在古代歐洲，人們認為男人的精子里面坐著一個微縮小人，他具備了一個成人一切的特征，只是十分微小。盡管隨著科學的發(fā)展，人們不再相信許許多多虛妄的傳說，然而對于遺傳的真正機制，科學家依然所知寥寥。1831年12月，查爾斯·達爾文乘上一艘名叫”貝格爾號”的小風帆艦駛離英格蘭的冬港，為人類帶來了進化論的曙光。達爾文進化論認為，生物有各種各樣不同的性狀，自然選擇的壓力定向改變著各種性狀在種群中的比例，從而驅(qū)動著魚兒登上陸地，恐龍飛上天空，猿猴拿起手機。然而，盡管達爾文因為進化論獲得了巨大的聲譽和成功，他自己的內(nèi)心深處卻比任何其他人都清楚進化論的致命缺陷：他沒有解釋各種各樣不同的性狀究竟是從何而來，又是如何傳給下一代的。達爾文在冥思苦想之中陷入了長久的精神痛苦。最終，達爾文認為，一種叫做泛子的微粒遍布于生物體各處的體細胞中，奔走著收集生物各處的信息。最終，滿載信息的泛子會匯聚在生物的精子或者卵細胞處，告訴生殖細胞，這是一個怎樣的生物，從而讓生殖細胞把信息傳給下一代。他把這種理論稱為”泛生論”。達爾文在提出泛生論后總算稍加釋懷地說道：“雖然這個假說還不盡如人意，但是對我而言已經(jīng)如釋重負?！?/span>
然而，弗萊明·詹金卻一針見血地指出：如果生殖細胞是通過從身體各處平等地收集來的泛子決定下一代性狀的，那么無論某個突變體具有多么特別或者優(yōu)良的性狀，過不了幾代，都會淹沒在大多數(shù)基因型的茫茫大海之中了。再怎么適應環(huán)境的基因型也不能被選擇，那么進化論也就成了空中樓閣。達爾文讀到詹金的批評后，不得不承認詹金說的是對的，然后再度陷入了精神痛苦之中，直到撒手人寰。
達爾文對于遺傳機制的錯誤見解被我國的高中生物課本稱作”融合遺傳”，我們現(xiàn)在知道，這個理論錯得離譜。如果不能解釋性狀是如何遺傳的，就不能解釋優(yōu)秀的基因型如何在種群中擴張其頻率，整座進化論的大廈也將不復存在。然而，實際上，達爾文和自己的救贖擦肩而過。進化論炸響一聲驚雷后，每年都會有許許多多形形色色的人給這位科學泰斗寫信，多到達爾文自己肯定看不完。而在這些被達爾文忽略的許許多多讀者來信中，有一封來自奧地利布爾諾的一位普普通通的神父：孟德爾。
孟德爾是一位熱愛大自然的天主教神父。他為人隨和、善良，和布爾諾當?shù)氐霓r(nóng)民群眾打成一片。布爾諾的農(nóng)民，像世界上其他地方的農(nóng)民一樣，祖祖輩輩都在有意識無意識地進行作物育種的工作。孟德爾在這里得到了通往基因奧秘至關重要的鑰匙：各種各樣純合的豌豆種子。之后就是收錄在高中生物必修二課本中，我們非常熟悉的故事了：孟德爾通過3:1和9:3:3:1的比例發(fā)現(xiàn)了分離定律和自由組合定律。孟德爾指出，生物的性狀，對應著一種神秘的，微小的遺傳物質(zhì)。這種物質(zhì)既不會融合，也不會消滅，成對存在。生殖時，成對的遺傳物質(zhì)彼此分離，不成對的遺傳物質(zhì)之間自由組合。
孟德爾拿著小小的畫刷，彎著佝僂的腰肢，在修道院后面的菜園子里，對著2.8萬株植物的小花兒一株一株地授粉，他總共收集了超過30萬粒種子，工作了整整十年，最終凝結(jié)出了一部44頁的偉大論文。孟德爾欣喜若狂地把開啟遺傳學的偉大發(fā)現(xiàn)寄給了著名植物學家內(nèi)格里，然而內(nèi)格里對于這個偏遠小鎮(zhèn)的貧窮神父的著作十分不屑，甚至沒有把孟德爾的巨作拿去給任何同事做進一步的評議。面對孟德爾一再熱情的邀約，正在研究山柳菊的內(nèi)格里就搪塞他，說，要是能用山柳菊做出同樣的結(jié)果，自己再考慮考慮采納孟德爾的理論。事實證明，選擇山柳菊展開遺傳學研究簡直是一場災難。這種植物有時有性生殖，有時無性生殖。在它有性生殖時，它給與孟德爾些微希望的光亮，當孟德爾心中升起希冀時，無性生殖又把這希望之火無情拍滅。1867年到1873年，孟德爾耗費數(shù)年的時間死磕這種令人絕望的植物，結(jié)果自然一無所獲，豌豆中昭然若揭的遺傳規(guī)律并沒有復現(xiàn)。1873年，孟德爾當選為布爾諾修道院院長。繁雜的行政工作占據(jù)了孟德爾的身心，最終，這位遺傳學之父同那位進化論之父一樣，帶著遺憾走到了人生的盡頭。
1900年，內(nèi)格里的學生貝特森在一次坐火車時偶然閱讀了孟德爾的巨作（內(nèi)格里根本沒有告訴他孟德爾給自己寫過信）。這位植物學家一下就被孟德爾的敏銳深深震撼了。他意識到，孟德爾的巨作是通往整個現(xiàn)代遺傳學的鑰匙，而它竟然被整個生物學界忽視了整整四十年。之后，貝特森自詡為”孟德爾的斗犬”，四處宣揚孟德爾的遺傳學說。然而，缺乏一個響亮簡潔的名號稱呼孟德爾模糊提到的遺傳物質(zhì)為現(xiàn)代遺傳學的發(fā)展帶來了巨大的阻礙。于是，1905年，貝特森根據(jù)希臘語genno（誕生）把這種既不消失也不融合的遺傳粒子稱為Gene，也即基因。
【注意?。?！這篇文章是我去年上半年寫的，當時我還沒有看中國旅德免疫生物學家商周所寫的《孟德爾傳》，我在本文中提到內(nèi)格里對孟德爾不好，是世間流行的錯誤看法。商周老師在閱讀了內(nèi)格里和孟德爾通信的史料原文以后指出內(nèi)格里其實對孟德爾不錯。在此勘誤，感興趣的朋友可以買一本《孟德爾傳》來看。】
第二章 抖擻精神：基因的化學本質(zhì)
隨著生物化學的發(fā)展，人類從細胞當中分離出了各種各樣的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)，由氨基酸序列構成，20種氨基酸就像是20個字母，連綴成一篇篇蛋白質(zhì)的書本。由于蛋白質(zhì)功能極多，在細胞中量極大，存在序列且序列多樣，生物學家自然而然地認為，所謂的”基因”，實際上就蘊含在蛋白質(zhì)的氨基酸序列之中。沒有人專門設計過實驗來證明蛋白質(zhì)就是遺傳物質(zhì)，卻也沒有人懷疑過這一點，直到一個無心之舉。
1918年，第一次世界大戰(zhàn)如火如荼，幾十萬人密密麻麻地堆在戰(zhàn)場上，塹壕和鐵絲網(wǎng)把綿延不斷的大軍分割在一個個人員密集的小塊里，無人處理的尸體和排泄物積壓在戰(zhàn)場上，自然成為了疾病的溫床。于是，伴隨著戰(zhàn)爭的物流通道和運兵船，西班牙大流感席卷全球，奪走了2000萬人的生命。為了處理西班牙大流感的繼發(fā)性肺炎鏈球菌肺炎，英國政府勒令英國衛(wèi)生部醫(yī)療官格里菲斯進行肺炎鏈球菌致病性的研究。格里菲斯發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌具有S型和R型兩種，其中只有S型會致病。吊詭的是，即使殺死S型菌，在把它們與R型菌混合在一起之后，R型菌中的一些也會轉(zhuǎn)化成S型菌，并獲得S型菌的致病能力。由于格里菲斯生性靦腆，他并沒有對這個能夠動搖遺傳學基礎的爆炸性發(fā)現(xiàn)大加宣揚，而是只是靜悄悄地將其發(fā)表在一篇很不知名的小期刊上。
直到1933年，美國生物學家艾弗里才讀到格里菲斯十幾年前發(fā)表的文章。艾弗里一開始并不相信一些細胞碎片就能傳遞遺傳信息，但是，在復現(xiàn)了格里菲斯的實驗后，他立即認識到，這是一個確定”基因”真面目的良機。艾弗里像當時的其他生物學家一樣，認為蛋白質(zhì)是遺傳信息的載體。于是，他用氯仿來洗脫蛋白質(zhì)，用各種蛋白酶來消化蛋白質(zhì)，加熱來使蛋白質(zhì)變性，加入酸性物質(zhì)使蛋白質(zhì)凝固?？墒牵趪L試了各種去除蛋白質(zhì)的手段后，剩余的S型菌殘渣依然能夠?qū)е翿型菌的轉(zhuǎn)化。然而，在S型菌中加入DNA酶以后，R型菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象竟然徹底消失了。當時，以DNA和RNA為代表的核酸剛剛發(fā)現(xiàn)不久。人們除了核酸具有A,T,C,G,U五種堿基以外，對其結(jié)構與功能一無所知。當時的生物學家想當然地認為，在DNA分子上，核苷酸堿基一定是以ATCGATCG循環(huán)往復的呆板方式排列的，因此稱DNA分子為”愚蠢的分子”。然而，艾弗里卻發(fā)現(xiàn)，”愚蠢的”DNA分子，其實有可能是基因真正的載體。
實際上，早在1902年，美國生物學家薩頓就在研究蝗蟲的精子和卵子的形成時發(fā)現(xiàn)，蝗蟲生殖細胞的染色體，和1900年貝特森宣講的孟德爾學說中所謂的”遺傳粒子”，在行為上具有高度一致性。因此薩頓就大膽假設：基因在染色體上。1907年，貝特森像摩爾根宣揚了孟德爾學說。摩爾根對孟德爾學說不屑一顧，因為他知道在果蠅當中有很多時候不同的性狀是有連鎖關系的，而非孟德爾所稱的自由組合?？墒?，當摩爾根按照薩頓的假設假定基因在染色體上之后，這種連鎖關系可以輕而易舉地得以解釋。當時人們已經(jīng)知道性別是由性染色體的不同決定的。如果雄性果蠅的X染色體上攜帶著隱性基因，那么它子一代的雌性個體所生的子二代將會出現(xiàn)性狀隨著性別而分化的現(xiàn)象。如果能夠觀察到這一點，就能反過來證明基因在染色體上。摩爾根為了這個隱性突變苦苦追尋了數(shù)年之久。1910年，一只千載難逢的白眼雄果蠅突變個體終于出現(xiàn)了。白眼相對于果蠅慣常的紅眼來說是隱性性狀，而當時已經(jīng)基本能夠推測白眼基因可能位于果蠅的性染色體上。摩爾根趕緊飼養(yǎng)，可是這只果蠅卻很虛弱，無論如何也完不成交配。它一天一天地大限將至，摩爾根只能眼睜睜看著重大發(fā)現(xiàn)從自己眼前溜走。好在這只白眼雄果蠅臨死之前抖擻精神，把珍貴的隱性突變傳播了下去，結(jié)果完全符合摩爾根的預期。
1943年，艾弗里面對著自己手頭的實驗結(jié)果，不禁再次想起了摩爾根在《基因論》中振聾發(fā)聵的呼告：基因在染色體上。染色體固然也有蛋白質(zhì)，但是蛋白質(zhì)在細胞當中無處不在。而染色體，卻是線粒體與葉綠體之外，DNA唯一富集的場所。所以，艾弗里指出，DNA在染色體上，基因在DNA上。后來，赫爾希和蔡斯又用病毒更加精確地復刻了肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗。至此，時隔41年，薩頓的大膽假設終于被證明為事實；時隔近百年，孟德爾發(fā)現(xiàn)的基因終于被牢牢地與堅實可感的物質(zhì)基礎聯(lián)系在了一起。
可是，DNA究竟有何特殊之處，使得它能夠承載傳遞遺傳信息的大任呢？以及，DNA分子如何復制，遺傳信息是如何在DNA上編碼的呢？DNA上鐫刻的遺傳信息，是如何變?yōu)榇笄澜缰行涡紊纳矬w的呢？
二戰(zhàn)后，倫敦國王學院的威爾金斯嘗試用X射線衍射技術破戒DNA結(jié)構。物理學家克里克加入了他的行列，很快，年輕的生物學家沃森也被吸引入了探尋DNA分子結(jié)構的隊伍之中。然而，DNA分子在不斷運動之中，導致很難拍出清晰可感的圖像。三人反復嘗試，都不得法。
1950年末，倫敦國王學院招募了一位新的晶體學家，她就是羅莎琳德·富蘭克林。富蘭克林是一個富裕的銀行家的女兒，雄心勃勃且聰慧過人。她也想要攻克DNA結(jié)構的秘密，于是和威爾金斯三人組一起工作。富蘭克林是一個難得一遇的晶體學家，她能夠拍出的X射線衍射照片，其精確性三人組遠不能及。可是，脾氣硬朗的富蘭克林很看不起三人組的做派，在她認為三人組十分愚蠢的時候，她從來不吝指責。有一次，沃森和克里克用鋼架搭建了一個模型，請富蘭克林來看。然而，沃森和克里克犯了一個巨大的錯誤：他們把磷酸骨架放到了中間，而把堿基暴露在外側(cè)。富蘭克林早就指出過，磷酸骨架都帶負電荷，他們放在一起會分崩離析，因此必然位于DNA分子結(jié)構的外側(cè)。因此，骨鯁的富蘭克林立馬就指出了這個錯誤，并且把沃森和克里克奚落了一頓。一來二去，富蘭克林和三人組的矛盾越來越大，以至于校方不得不把他們的實驗室分開。富蘭克林后來繼續(xù)拍攝了更多越來越清晰的X射線衍射照片。
1952年，富蘭克林終于拍攝出了前所未有的極其清晰的X射線衍射照片：51號衍射照片。結(jié)果威爾金斯竟然在富蘭克林不知情的情況下把這張至關重要的照片從抽屜中抽走，私自交給了沃森和克里克。沃森和克里克立馬就看出來了DNA分子具有螺旋結(jié)構，排除了不穩(wěn)定的三螺旋后，他們認為DNA分子具有雙螺旋結(jié)構?？墒?，富蘭克林告訴過他們，DNA分子的磷酸骨架在外，堿基對在內(nèi)。可是，犬牙呲互的堿基長短不一，他們是如何穩(wěn)定地保持在DNA分子內(nèi)部的呢？不久，奧地利化學家查哥夫發(fā)現(xiàn)了一個至關重要的結(jié)論：在DNA的堿基當中，嘌呤與嘧啶總是總量相等。這意味著AT和CG堿基之間很可能存在對應關系。這樣配對以后，各種堿基就能長短對齊，中間依靠氫鍵緊密連接。至此，關于DNA分子結(jié)構的最后陰云已然散去。1953年，沃森和克里克發(fā)表了揭示DNA結(jié)構的論文，它無可置辯地確認了DNA分子的雙螺旋結(jié)構，翻開了基因研究的新紀元。最終，沃森、克里克和威爾金斯因此獲得諾貝爾獎，而可憐的富蘭克林卻因為拍攝了太多X射線衍射照片，接受了太多輻射，在37歲時因卵巢癌英年早逝。
沃森和克里克后來又揭示了DNA分子的半保留復制機制：在DNA復制時，DNA的兩條鏈解開，在各種酶的作用下，各自按照堿基互補配對原理合成一條子鏈。隨后的研究又發(fā)現(xiàn)，DNA解開的雙鏈可以作為RNA復制的模板，由DNA為模板合成RNA分子的過程稱為轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄出的RNA分子又可以在核糖體的作用下通過三聯(lián)密碼子來對應氨基酸，從而合成蛋白質(zhì)，這個過程稱為翻譯。至此，遺傳信息從DNA流動到RNA，再流動到蛋白質(zhì)的路徑被全部解明，克里克稱之為”中心法則”，以昭示它在生物界無可動搖的中心地位。后來，隨著逆轉(zhuǎn)錄病毒和朊病毒的發(fā)現(xiàn)，中心法則又增加了信息從RNA流動到DNA，以及從蛋白質(zhì)流動到蛋白質(zhì)的通路。
漸漸地，人們發(fā)現(xiàn)，并不是DNA分子上哪里都能作為合成蛋白質(zhì)的模板。有的地方可以轉(zhuǎn)錄出RNA，卻不能翻譯出蛋白質(zhì)。還有的地方，甚至壓根不能轉(zhuǎn)錄出RNA。能翻譯出蛋白質(zhì)的DNA片段，顯然作為基因承載著各種各樣的性狀的實現(xiàn)。只能轉(zhuǎn)錄出RNA的DNA片段，雖然不能直接作為蛋白質(zhì)作用，但是RNA本身也可以作為tRNA、rRNA甚至酶來調(diào)控各種各樣的生命活動，所以這樣的DNA也是基因，只不過是非編碼的基因片段。因為孟德爾當初定義”遺傳因子”的時候就是以指導生物產(chǎn)生性狀為基準的，所以生物學家把能夠轉(zhuǎn)錄的，或者說，具有遺傳效應的DNA片段都稱為基因，而把沒有生物學功能的DNA片段排除在基因以及自然選擇之外。
至此，歷經(jīng)百年，我們終于可以滿懷信心、擲地有聲地說出高中生物必修二里的那句定義：
基因是具有遺傳效應的DNA片段。 ? ?
第二部分 基因測序時代
人們通常認為，科學進展有賴于新技術，新發(fā)現(xiàn)與新設想的實現(xiàn)。 ? ? ? ——悉尼·布倫納
第一章 沼澤旁邊的夢：桑格測序法
僅僅是知道了基因在哪里，DNA怎么復制，他們怎么受到調(diào)控，并不能解決我們真正關心的問題，那些真正關乎實際的問題：ATCG構成的核苷酸文本，究竟表達了什么豐富多彩的意思？他們怎么指導生物體的形成，又會指導生物體發(fā)生哪些生理活動？如果這個文段損壞了，對生物有什么影響？我們能按照自己的意愿編輯基因文本，從而定向改變生物性狀嗎？
要了解基因的作用，20世紀60年代的遺傳學家手頭唯一的手段就是通過研究變異個體。長了兩個胸結(jié)的果蠅，腿長在觸角的部位的果蠅，各種稀奇古怪的肢體移位，最終為遺傳學家開啟了認知Hox基因的大門。然而，天然的情況下突變十分稀少，不能供給研究所需。遺傳學家從二十世紀初的摩爾根時代開始就開始利用各種物理、化學的方式誘發(fā)變異。比如使用x射線進行長時間照射，或者使用各種影響復制甚至致癌的化學品誘導果蠅突變，然而，誘變法一方面成功率不高，另一方面沒法控制變異方向，更沒法精確解讀自己感興趣的基因。最重要的是，這一招不能用到人身上。已有的方法嚴重制約了遺傳學家滿溢的求知欲，連在原子彈轟擊下的廣島和長崎幸存的1.2萬名日本人都被作為了誘變的研究對象，即使這樣也不能滿足對于人類基因了解的需要。
我們分離了一個DNA分子，不是只想知道其上偶發(fā)幾個變異位點的殘片斷簡，而是想要能夠閱讀從頭到尾的DNA序列。也許我們還不能理解這些序列的含義，但是，沒有序列，就沒有一切。
一切是從英國劍橋大學一所位于沼澤附近的，半地下式的”簡陋”實驗室開始的?？傤I這一方小天地的領主，名叫弗雷德里克·桑格。20世紀50年代伊始，世界大戰(zhàn)的暗影剛剛散去，連DNA結(jié)構都尚未被沃森和克里克揭示的時候，他就已經(jīng)在這里創(chuàng)造了一套完整的蛋白質(zhì)測序技術了。桑格首先攻克的，是一種對糖尿病患者至關重要的激素蛋白：胰島素。隨著人類歷史逐漸從近代過渡到現(xiàn)代，現(xiàn)代化的生活方式帶來了越來越多的糖尿病病例。然而，直到1921年提取出胰島素之前，這種疾病都是不治之癥。胰島素的提取并沒有成為糖尿病患者的福音，因為它太昂貴了。激素的活動本來就具有高效性，很少的含量就能發(fā)揮作用。更不用提提純過程中還要有損耗。結(jié)果是，宰殺幾十條狗，十幾頭豬或者牛，把它們的胰腺全都割下來磨碎了，最后也只能提取出幾克胰島素來。這樣的”藥品”對人類社會毫無意義。人類必須掌握人工合成胰島素的方法。為了做到這一點，首先就必須知道胰島素蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
桑格創(chuàng)造性地采用一系列降解的方式來為胰島素測序。他先運用生物化學的手段，把胰島素末端的一個氨基酸切下來，溶解在溶劑里，然后鑒定這個氨基酸（對單個氨基酸的化學鑒定已經(jīng)非常成熟），接著重復這個過程，直到抵達蛋白質(zhì)的另一端。當胰島素被徹降解的時候，它的氨基酸序列也就已經(jīng)探明了。1958年，以極其驚人的短審批時間，桑格就獲得了諾貝爾生理學與醫(yī)學獎。
創(chuàng)造蛋白質(zhì)測序法以后，1955年到1962年，桑格繼續(xù)解明了好幾種重要蛋白質(zhì)的序列。毫無疑問，社會對桑格的貢獻進行了熱烈的追捧。然而，桑格并非是一個胸無大志的凡俗之輩。他感到，自己這些年的工作，實際上不過是把胰島素測序重復了一遍又一遍罷了。桑格后來回憶稱，自己在這些年里”毫無建樹”。
1962年，桑格的實驗室搬遷到了劍橋大學醫(yī)學委員會，和克里克、佩魯茨和悉尼·布倫納的實驗室相鄰。這些科學家，尤其是揭示DNA結(jié)構和提出中心法則的克里克，全都是熱情的DNA迷。結(jié)果是，自然而然地，20世紀六十年代中期，全世界生物大分子測序方面的泰斗：弗雷德里克·桑格，正式向DNA測序的桂冠發(fā)起了進軍。
桑格自然而然地把蛋白質(zhì)測序的方法應用到了DNA身上。他試圖一個一個降解DNA的核苷酸，然而，由于缺乏合適的酶，桑格無法每一次都僅僅把最末端的一個核苷酸從DNA鏈上切除。桑格花費了數(shù)年時間改進降解流程，然而最終，整個DNA分子被各種各樣的酶切的七零八落，以至于根本沒法判斷哪一段在原來鏈上的什么位置。
1971年冬天，桑格嘗試逆向考慮這個問題。DNA分子的降解是如此亂暴，和DNA分子秩序井然的合成反應形成了鮮明的對比。如果，我們不是利用降解，而是利用合成呢？DNA分子的合成也是一個核苷酸一個核苷酸加上去的。如果我們能夠在每加一個核苷酸的時候得知DNA加了什么核苷酸上去，那么等整個合成反應結(jié)束的時候，我們不就得到了DNA的整個序列了嗎？我們有很多方法實現(xiàn)這一點，比如說，給我們提供的核苷酸加上熒光標記，或者放射性標記，又或者是比重不同的同位素?？墒牵覀儧]法暫停DNA分子的合成進程。如果任由DNA分子一股腦兒地合成完畢，我們只能得到一條滿是無法辨認的標記的鏈。如果我們加進去的這個核苷酸，可以使DNA分子的合成暫停就好了...等等，確實可以這么做！構筑DNA的核苷酸，實際上是脫氧核糖核苷酸，和構成RNA的核糖核苷酸比少了一個羥基。要想形成磷酸二酯鍵，就需要核苷酸的五碳糖上有羥基。核糖核苷酸的五碳糖上有兩個羥基，對于脫氧核糖核苷酸來說，盡管少了一個，依然還有一個羥基可以用來形成磷酸二酯鍵，所以DNA鏈的構建還能正常進行。如果把這個剩下的羥基也用化學方法脫去呢？那么磷酸二酯鍵不能構建，DNA合成也就會被暫停了。
桑格趕緊構建了雙脫氧的核糖核苷酸。如果給DNA合成反應提供正常的ATP,TTP，CTP和GTP，同時再在里面加入適當比例的ddATP，用待測的DNA分子作為模板擴增許多次，最終得到的許多子鏈當中就會有在各個A堿基處停止擴增的短鏈，他們長短不一，且末端堿基全部已知：腺嘌呤（A）。我們可以利用業(yè)已成熟的電泳法把這些長短不一的DNA子鏈分離開：先給各個DNA短鏈加上相同的電荷，然后放在相同的電場的同一條起跑線上，讓他們在電場場力的作用下運動相同時間，由于qE=F=ma，q和E都確定，則DNA短鏈的移動加速度a只取決于其質(zhì)量m，換句話說就是其長度，所以電泳過后就能把混在一起的DNA子鏈按照分子量大小的順序依次排開。
這只確定了一種堿基的分布。桑格設計了四條平行電泳槽，分別加入ddATP，ddTTP,ddCTP，ddGTP，調(diào)整好雙脫氧核糖核苷酸和正常脫氧核糖核苷酸的比例，就能夠使每一個位點都存在一個在這里截止的短DNA子鏈，這樣電泳完了以后只要看看四個電泳槽中從遠到近的DNA條帶分布順序，就能從前到后地讀出DNA分子的序列。
1975年，桑格把DNA測序方法改進到了我們上述的水平。1977年，他在《自然》雜質(zhì)發(fā)表論文，昭示全球：桑格已經(jīng)利用一種嶄新的技術手段測出了ΦX174病毒的全部DNA序列，其中包含9個基因?，F(xiàn)在，曾經(jīng)的蛋白質(zhì)測序泰斗弗雷德里克·桑格，已經(jīng)讀懂了基因的語言。后人把這種測序方法稱為第一代基因測序法，也叫桑格測序法。
其實，在桑格開發(fā)自己測序法的同時，哈佛大學的吉爾伯特和馬克西姆也在研究類似的測序法，他們利用一種特殊的磷酸基團來起到相同的終止DNA復制的效果，但是效率遠遠比不上桑格測序法。后來，人們給四種雙脫氧核糖核苷酸帶上了熒光標記，這樣一來可以把所有的脫氧核苷酸和雙脫氧核苷酸都加在一個池子里，只需要一條電泳槽，就能夠通過顏色的排列讀出DNA上的全部序列。這種改進的桑格測序法被一些人稱為”第1.5代基因測序法”，半自動化的改進桑格法最終成為了人類基因組計劃的主力方法。
為了制造出足夠多的DNA子鏈，桑格法需要大量的純化過的目標DNA分子。彼時穆里斯還沒有發(fā)明能夠在體外快速擴增DNA的PCR技術，所以如何獲取大量的目標DNA片段成為了DNA測序的一個技術難題。幸好，也在20世紀70年代，在桑格致力于桑格法的開發(fā)的同時，美國科學家伯格，博耶和科恩開發(fā)出了通過病毒轉(zhuǎn)染或者細菌重組質(zhì)粒來在不同物種中平行轉(zhuǎn)移DNA片段的技術，人類可以把想要的DNA片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌之類的常見無害細菌體內(nèi)，在搖床上的液體培養(yǎng)基里大規(guī)模培養(yǎng)。這就是DNA的分子克隆技術。有了分子克隆，桑格法終于可以放開手腳，測遍所有模式生物的序列了。
哈佛大學的吉爾伯特盡管在創(chuàng)制測序方法上輸給了桑格，但是他在解讀獲得的序列方面取得了巨大的成就。吉爾伯特發(fā)現(xiàn)，對于真核生物來說，并不是所有的蛋白質(zhì)都是由一大段相連的堿基對編碼的。確切地說，基因會被漫長的非編碼序列切的七零八落。在轉(zhuǎn)錄出mRNA后，還要用一系列復雜的生化反應把這些非編碼序列切除，把剩下的mRNA片段連在一起，才能進行翻譯。吉爾伯特稱這些無意義的間隔為內(nèi)含子，而稱編碼序列為外顯子?；虮环指畛梢粋€個的外顯子體現(xiàn)了模塊化的思想。用印刷術作比喻，一塊完整的基因就如同一塊完整的雕版，而一個個分離的外顯子就像一個個活字。如果需要印刷一本500頁的英文書籍，就需要500塊各不相同的雕版，然而僅僅26個字母活字加上少許的幾個標點符號就足以完成同樣的工作。這使得真核生物可以用并不多的基因量來實現(xiàn)復雜而多樣的功能，至此，基因的數(shù)目和生物的復雜性已經(jīng)沒了關系。人類有20000到30000個基因，在基因的世界并不算很多，數(shù)目甚至比不上玉米。
而早在1970年就被人類發(fā)現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)錄酶更是讓桑格法的應用又升華了一個層次：逆轉(zhuǎn)錄酶可以利用RNA還原出作為其模板的DNA，換句話說，通過提取細胞當中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄后對其對應DNA進行桑格測序，就能識別出究竟是哪個基因指導了這個RNA的表達！至此，不同基因的表達量也納入了已知世界的范疇。我們甚至可以通過追蹤對應RNA的翻譯產(chǎn)物來讀出一段DNA序列的功能?。。?/span>
桑格，伯格和吉爾伯特解決了基因測序的實現(xiàn)與測得基因序列解讀的重大問題。因此，他們?nèi)擞?980年獲得了諾貝爾生理學與醫(yī)學獎。這已經(jīng)是桑格第二次站在諾貝爾獎的領獎臺上了。第一代測序技術已經(jīng)如此成熟，然而人們還僅僅沉醉于解開果蠅或者秀麗隱桿線蟲的遺傳密碼。是時候展開一些真正的大項目了。
第四章 基因大戰(zhàn)爭：人類基因組計劃
時間來到1986年。在剛剛過去的十年中，第一代測序技術已經(jīng)成功定位和測序了許多十分重要的人類遺傳病基因，比如亨廷頓舞蹈癥和血友病基因。到了80年代末期，科學家已經(jīng)徹底摒棄了”大多數(shù)遺傳疾病都是由單基因調(diào)控的”這樣的美麗幻想。事實證明，絕大多數(shù)的遺傳病，都是由多個基因共同調(diào)控的，最典型的就是癌癥。癌癥的發(fā)病，甚至可能涉及到幾十上百個基因的突變。僅僅了解單個基因已經(jīng)不足以滿足時代發(fā)展的需要。DNA之父沃森的兒子，在這個時候因為精神疾病被關進了醫(yī)院，而已經(jīng)有充足的證據(jù)表明精神疾病和遺傳因素有關。悲苦的沃森堅信，兒子的病癥是由多基因調(diào)控的。只有一種方法可以挽救千千萬萬這樣的孩子：對人類的整個基因組，30億個堿基對進行全部測序。
人類基因組計劃的根源來自1986年沃森在美國冷泉港舉辦的”現(xiàn)代人的分子生物學”主題會議。許多英雄豪杰齊聚于此，在這場盛會上拋出了各自的劃時代的技術發(fā)明。其中凱利·穆里斯帶來的技術最為關鍵：聚合酶鏈式反應，簡稱PCR。對于漫長龐大的人類基因組來說，想通過原核生物來進行分子克隆可行性很低。PCR技術能夠廉價快速地在體外合成大量的基因，這使得人類基因組計劃成為了可能。埃里克·蘭德是一位數(shù)學大師，他帶來了一種全新的算法，使得人們可以鎖定遺傳病和對應基因序列的關系。勒羅伊·胡德則帶來了加州理工大學研制的一種半自動測序儀，它比傳統(tǒng)的桑格法測序快上20倍，更是大大解放了測序工作的生產(chǎn)力?。?/span>
最終，1989年，史無前例的人類基因組計劃正式上馬了。這個龐大的計劃依靠的是一種在今天看來非常原始落后的技術手段：桑格測序法，從而產(chǎn)生了一種宛如中國科學家拿算盤往出打原子彈一般的不協(xié)調(diào)感。這一方法花費很大，只靠科學家自發(fā)無法完成。于是，美國國立衛(wèi)生研究院下場，開始爭奪這個民間自發(fā)的宏大計劃的主導權。很快，英國，德國，日本，中國也加入了項目。然而，美國國立衛(wèi)生研究院麾下的一名叫做文特爾的生物學家卻對整個計劃的測序方法產(chǎn)生了離經(jīng)叛道的見解。
摩爾根時代，在還不清楚基因的分子基礎的時候，人類就發(fā)明出了把基因定位在染色體上的方法。到了90年代，基因定位已經(jīng)相當成熟。人類基因組計劃的打算是，利用基因定位技術先確認不同基因彼此之間在物理上的關聯(lián)和位置關系，然后再進行大段的桑格測序，最后把這些序列一拼就好了。然而，漫漫的堿基之海中相當大一部分都是非編碼序列，基因片段如同一座座小島。一點一點慢慢探尋整個序列的做法無疑會使得人類基因組計劃進展緩慢。
文特爾認為，我們只需要關心短小的序列?？梢韵劝颜麄€基因組用類似鳥槍的裝置擊碎成上百萬個微小的片段，然后隨機選取幾十萬個序列進行測序，最后通過不同序列之間重疊的部分通過計算機算法把他們連在一起。比如說，我們有許多”1145141919810”這樣的文本，把這些文本隨機擊碎，我們可以得到”1145”，”4514191”，”1919810”這樣的片段，通過算法，就可以還原出原文。這種測序方法被文特爾稱為”鳥槍法”。
然而，人類基因組計劃委員會對文特爾的設想展開了無情的批判。首先，把上百萬個片段準確無誤地連在一起，其中的運算量就大的無法估計，要開發(fā)這樣的算法更是難上加難。以及，經(jīng)過這樣的隨機選取，我們可能測了人類真實基因組中的百分之七八十，就樂樂呵呵地開香檳慶祝人類基因組計劃的完成了，人類基因組那些沒有被文特爾抽中的片段將會永遠遺失在黑暗之中。
文特爾對委員會和美國衛(wèi)生院的謹小慎微十分不滿。他認為，要想得到高回報，就得承擔高風險。于是文特爾離開了人類基因組計劃的隊伍。他離開人類基因組計劃之后甚至想要為自己測得的序列申請專利，這更是引發(fā)了一片嘩然。文特爾走后自己創(chuàng)立了TIGR公司，企圖憑借一己之力用鳥槍法把人類基因組測出來。1993年，為了證明鳥槍法的可行性，文特爾公布了利用鳥槍法測得的流感嗜血桿菌完整的基因組。對此，測序之父桑格對此表示了盛贊。由于TIGR有國家注資，文特爾后來又離開TIGR創(chuàng)立了celera公司，并于1998年發(fā)表了秀麗隱桿線蟲的全基因組序列，把鳥槍法的熱度又炒上了一個臺階。即使是鳥槍法的反對者也不得不承認，盡管確實會有所遺漏，但是鳥槍法得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量確實也很好，而且和逐步克隆法相比快的多的多。差不多同時期，人類基因組計劃才完成了三分之一。文特爾的celera在2000年又發(fā)表了果蠅的全序列以后就立馬把所有的產(chǎn)能投入到了人類基因組的測序當中，一定要和人類基因組計劃試比高。面對咄咄逼人的文特爾，克林頓總統(tǒng)先斡旋文特爾和人類基因組計劃在2000年末共同宣布了人類基因組”初步測序的完成”，然而彼時雙方都沒有做完手頭的工作，在虛情假意的停戰(zhàn)之后就各自瘋狂地投入了測序工作當中。
2001年初，文特爾和人類基因組計劃的矛盾終于無法按捺。他們雙方分別在《科學》和《自然》上發(fā)表了自己的成果，以及對對方陣營的攻擊之辭。其中，人類基因組計劃發(fā)表的雄文長達六萬六千字，是有史以來《自然》雜志刊登過的最長文章之一。時至今日，文特爾本人和他的鳥槍法依然沒有擺脫爭議。但是，可以斷言，如果沒有文特爾的興風作浪，人類基因組計劃恐怕無法在2001年就早早完成。
人類基因組計劃vs文特爾是世紀之交最為轟轟烈烈的科學大戰(zhàn)。由于雙方都急于發(fā)表成果，導致測序結(jié)果其實并不完備，歷史遺留問題直到近年才得以解決。然而，正當人類基因組計劃和文特爾激戰(zhàn)正酣時，一個新的勢力正在暗中崛起，他不但會引領新的測序時代，而且還會徹底把歷史悠久的桑格法掃進”過時事物”的行列。它就是illumina公司，第二代測序技術的發(fā)明者。
第五章 乖巧的分子：illumina測序
illumina本來是一家銳意進取的小公司。幾個主創(chuàng)人員在八十年代末相識，經(jīng)歷了十年的洗禮，于新世紀初正式開始提供服務。可以說，illumina眼睜睜地見證了桑格法的巔峰和人類基因組計劃劍拔弩張的亂戰(zhàn)。這一切的爭斗都是源于一件事：傳統(tǒng)桑格法不夠高效。可以說，人類基因組計劃把第一代測序的孱弱暴露無遺。只要能夠從根本上開發(fā)出一種新型的高效測序方法，就能夠擊破加州理工大學的測序儀業(yè)務和文特爾的celera帝國，把全世界的測序業(yè)務統(tǒng)一在自己的麾下。要想做到這一點，就必須創(chuàng)制一種高通量測序的方法。
所謂高通量，指的是一次對成百萬上千萬的DNA序列進行測序，從而大大提高測序效率。傳統(tǒng)桑格法的問題在于”先合成，后測序”，把帶熒光的ddNTP加入，等到DNA擴增完了，再拿到電泳槽里跑電泳，一次只能測一小段，之后還得再反復合成，測序，十分麻煩。也許我們不用這么做——請你想象這樣一個場景：一臺超級精確的顯微攝像機為整個DNA分子合成的過程錄著像。我們把大量熒光標記了的dNTP投放進去，也許A是黃色，T是紅色，C是藍色，G是綠色，然后DNA在合成酶的作用下開始合成。帶A堿基的核苷酸結(jié)合上去了！一道黃色閃光劃過，咔！攝像機拍下了一張散發(fā)著黃色光芒的照片。緊接著是G，綠色！C，藍色...每一張照片都作為序列信息實時保存在電腦里面。最終，當合成結(jié)束的時候，我們已經(jīng)有了這段DNA分子的完整序列，合成和測序同時進行，也就是所謂的”邊合成，邊測序”。
然而，首先，酶的催化具有高效性，這使得現(xiàn)實中DNA分子合成的速度極快，你根本來不及拍照，新的核苷酸就連接上去了。其次，單個核苷酸發(fā)出的熒光過于微弱，根本無法被有效探測。再次，好幾種核苷酸一起發(fā)出熒光，結(jié)果就是哪一個核苷酸的顏色都看不清楚。要是能有一種特制的核苷酸，連到鏈上去以后立馬暫停合成，老老實實地等我們拍完照以后，自動消散自己的光芒，然后重新開啟合成反應，讓下一個帶著熒光的核苷酸連上來，那該多美好??！啊，同時，還要有幾百萬條這樣的鏈，同步進行一樣的行為，同步發(fā)出一樣的熒光，從而讓我們的攝像機可以清清楚楚地看見。
這樣的技術設想并非完全的科幻小說。首先，能夠暫停合成的核苷酸，早在1975年就被偉大的桑格發(fā)明出來了。問題僅僅在于如何再次開啟合成。illumina決定對核苷酸采取新的編輯方式，不是通過把3號碳原子上的可憐核糖的最后一個羥基也去掉，而是使用一個疊氮基作為”蓋子”把這個羥基給蓋住，這樣一來，當我們用化學方式把這個疊氮基洗掉的時候，就能讓被掩蔽的羥基暴露出來，再次構建磷酸二酯鍵了，由此，合成反應也就可以繼續(xù)進行了。這就叫做”可逆轉(zhuǎn)的合成終止”。有了這個思路，我們不難想到如何讓熒光消失。illumina公司在核苷酸的堿基上鏈接了一個可以通過化學方式洗掉的熒光物質(zhì)，就解決了這個問題。
最終的難關就是DNA的擴增了。為此，illumina公司設計了一種Flowcell（可以翻譯為”流動池”），這是一個載玻片大小的玻片，里面有八條流動槽，相當于一個基因芯片（關于基因芯片技術，在此不展開講述），里面密密麻麻分布了上億條DNA引物序列，總共兩種，通過共價鍵牢牢地結(jié)合在流動槽底。這兩種DNA的序列是人為設計的，也是我們已知的。在測序前，把目標DNA片段的兩端用連接酶黏上設計好的引物序列，分別和池子里的兩種序列互補，就像鞘或者帽子一樣，然后把目標DNA片段放到流動池里，這個”帽子”就會與池子里的DNA互補配對，之后用DNA合成酶在池子里錨定在池底的DNA引物上合成出原來目標片段的互補鏈，洗去原來的目標片段，就得到了緊緊結(jié)合在池底的完整DNA片段了。可以把這樣的DNA簡化為”A端——目標DNA序列——B端”的模式，如果連在池底的是A端，在上方飄蕩的B端就會彎下腰來，和其他連在池底的B端DNA序列互補配對，然后再用合成酶合成，就可以在另一個錨點也復制一個一模一樣的DNA序列。其中，堿基互補配對的開始于停止可以通過池中洗液的酸堿性調(diào)節(jié)。這樣，就可以大量擴增DNA序列了，這個過程稱為”成簇”。
成簇以后的事情就按部就班了：帶熒光物質(zhì)和疊氮基帽子的核苷酸合成上去，合成停止，照張相，洗掉熒光物質(zhì)，洗掉疊氮基，合成繼續(xù)，循環(huán)往復...整個流動池中密密麻麻上一條DNA序列都會同步進行這一工作。
這就是所謂的illumina測序法。#（更進一步的技術細節(jié)請明瑤整合）
illumina測序法可以一次性完成上億個DNA片段的測序，其通量之高令人咋舌。另外，由于只需要加加藥品和換換洗液，可以做到相當高的自動化程度。截至2022年，illumina已經(jīng)把測一個基因組的花費降低到了600美元，并且計劃在近幾年內(nèi)把這個花銷降低為100美元。要知道，2001年完成的人類基因組計劃利用桑格法，每測一個堿基對就要花1美元（出自吉爾伯特的計算），而人類基因組足足有30億個堿基?。。llumina測序和所有第一代測序根本上不是一個維度的東西，當人們輕飄飄地稱其為”第二代測序技術”時，你要知道”第二代”這三個字中蘊含的分量。
然而，不要忘記，illumina法也只能測幾百個堿基對的短鏈。所以，在illumina測序前，要先把完整的DNA序列用超聲波打碎成幾百萬個片段......我知道你想到了什么，鳥槍法！沒錯，illumina并不是孤立的，它在合成終止方面的思想幾乎完全承繼自桑格法，而它片段測序的思想則來自文特爾的瘋狂設想。感謝文特爾的公司對序列分析算法做出的巨大貢獻，這使得illumina在創(chuàng)制自己的拼合片段序列的算法時輕松了不少。
時至今日，illumina的測序儀幾乎占領了全世界的所有測序市場。2020年初，新冠疫情爆發(fā)，中國科學家很快就測出了新冠病毒的序列，用的是illumina的測序儀。2021年，美國輝瑞公司開發(fā)針對mRNA疫苗，用的還是illumina公司提供的序列信息。illumina的聲威已經(jīng)如此昌盛，以至于基因泰克，TIGR或者celera的輝煌往事都已經(jīng)鮮少有人提起。從封建時代的遺傳觀啟航，隨著我們的時間軸來到現(xiàn)代，按道理這個故事也該告一段落了。可是，在最后一章，我會邀請你窺探未來的倩影。歡迎來到：第三代測序！
第六章：未來的邊界：第三代測序技術
不管是桑格測序還是illumina測序，都局限于對小DNA片段的測序。最終，都要面對一大堆雞零狗碎的序列，調(diào)用能讓主板熱得能煎雞蛋的那么多運算力，設計非常復雜的算法來把它們拼在一起。那么，能不能直接對一長段序列，甚至一個完整的DNA分子進行測序呢？
我們可以想象，如果可以讓一個完整的DNA分子不停合成，不停進行互補配對，同時能夠有一種非常敏感的裝置實時檢測每一個堿基的安裝，那么就可以實現(xiàn)對一個長序列的完整測序。這樣的技術不需要任何”合成終止”的要素。所以說，如果說illumina測序的核心深處依然有一個桑格測序的靈魂的話，那么第三代測序技術則就完全拜托了合成終止的桎梏，這也是第三代測序之所以可稱為新一代技術的關鍵因素。第三代測序技術的核心，是小到納米級別的孔。
早在1993年，科學家就實現(xiàn)了讓完整的DNA分子通過α-hemolysin納米孔。這為十幾年后納米孔技術的研發(fā)打下了堅實的基礎。2008年，在第二代測序技術發(fā)展的如火如荼的同時，Jens Gundlach就利用MspA納米孔首次成功測定了單個DNA分子的序列信息?？梢哉f，第三代測序技術盡管叫做第三代，但是實際上很大程度上是和第二代共同發(fā)展的。
納米孔技術的核心是利用電場驅(qū)動帶電荷的DNA分子通過一個蛋白質(zhì)納米孔，一系列蛋白質(zhì)和酶幫助DNA分子勻速運動。每一種核苷酸，因為攜帶堿基的不同，具有的帶電性和空間構型也不同，因此在通過納米孔時會對過孔電流產(chǎn)生輕微的擾動。用電極連接蛋白孔，就能夠記錄并解析這些擾動，并且實時記錄整個DNA分子的序列信息。在這個領域，牛津大學處于領先地位（還記得桑格是劍橋大學出身的嗎？）。
第三代測序技術的好處顯而易見。它不但可以免于拼接大量DNA小片段，而且利用物理手段，甚至還能夠探測到表觀遺傳的變化（簡單地說，表觀遺傳就是指DNA分子被其他基團修飾的現(xiàn)象）！然而，盡管免于了拼接算法，講電信號序列翻譯為氨基酸序列的工作又需要一種新的算法，在第三代測序中一般被稱為basecalling。此外，由于電信號容易受到各種因素的擾動，即使有諸如反向再測一次的校正機制，第三代測序的錯誤率和illumina比依然非常高。最后，把第三代測序阻擋在廣泛應用之外的最重要的門檻是它相對于illumina測序高昂的成本。
第三代測序是基因測序的未來嗎？納米孔會取代所有合成終止型的測序方法嗎？我不知道。但是，我們從歷史中得到的教訓告訴我們，永遠不要輕視任何一個技術儲備的發(fā)展?jié)摿?。隨著表觀遺傳學在生物學中日益成為顯學，第三代測序技術可能會在技術迭代和成本縮減的過程中日益逼近屬于它的新王座。
尾聲
達爾文現(xiàn)在終于可以安眠了。在他身故以后，遺傳學的發(fā)展從根本上拯救了進化理論，把達爾文主義和基因遺傳相結(jié)合的現(xiàn)代綜合進化理論，時至今日依然被進化生物學家奉為圭臬。有了基因序列的測定技術日新月異地發(fā)展，和化石證據(jù)相結(jié)合，我們甚至可以編制出分子鐘，以堿基為單位精確地測量進化速率。DNA之父克里克說過，”每個人都有自己的現(xiàn)代音樂”。在自動測序儀，搖床和恒溫培養(yǎng)箱運行時咯啦咯啦的旋律中，達爾文和孟德爾的迷夢被以一種前所未有的精確性定量描述了。進化與遺傳的圖景從未像現(xiàn)在這樣清晰過。
然而，人類面前的問題，和19世紀相比非但沒有減少，反而變得比那時還多得多。內(nèi)含子有什么深層作用？DNA是怎么起源的？DNA的表達是如何調(diào)控，以至于細胞分化與凋亡的？我們能利用基因序列破解干細胞返老還童的秘密嗎？或者說，我們能利用基因測序診斷甚至治愈癌癥嗎？基因能夠作為疫苗使用嗎？遺傳病可以治愈嗎？DNA的表觀修飾是怎么遺傳的？基因能在多大程度上決定一個人的命運呢？只要生物科學還存在一天，這樣的問題現(xiàn)在不會有，將來也永遠不會有其盡頭。而要解答所有這些問題，要不然就要訴諸基因測序本身，要不然就要以基因測序為基礎。我們可以斷言，基因測序的歷史還在進行之中。
參考資料
悉達多·穆克吉《基因傳》
詹姆斯·沃森《雙螺旋》
高中生物《必修二》
illumina公司官網(wǎng)https://illumina.com/
illumina公司官方原理介紹視頻https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8
第三代測序簡介
