文獻信息

EST2023,Dittmar老師→此領域的大牛"，注：本文整理供本人自己學習

摘要
??確定溶解有機物(DOM)分子組成的驅動因素對于了解全球碳循環(huán)至關重要。然而，由于影響DOM組成的因素混雜，對觀察到的模式進行明確的解釋是具有挑戰(zhàn)性的。在本文獻中，Kida等人通過超高分辨率質(zhì)譜法和核磁共振波譜法等對于南極洲東部的43個湖泊中DOM的組成進行了探索。研究結果表明，不同湖泊中DOM分子組成差異顯著，這些湖泊與陸地輸入和人類影響隔絕。這些湖泊中DOM的組成主要受光降解程度、硫化程度和pH值差異的影響。DOM的分子β多樣性顯著，與河流與深海DOM的差異相當，后者主要受環(huán)境差異而非空間距離的影響。該研究強調(diào)了即使在地球上最原始和有機質(zhì)來源有限的環(huán)境中，DOM的廣泛分子多樣性也可能出現(xiàn)，同時DOM的組成可以通過環(huán)境變量和湖泊的生態(tài)歷史來預測，研究結果有助于進一步理解DOM隨時間推移的分子演替以及組成的特異性等。

關鍵詞??碳循環(huán)，DOM，淡水，質(zhì)譜，核磁共振，光降解

Q1.硫化程度是怎么確定的，什么指標？
Q2.分子β多樣性顯著是用什么方法確定的？

主要內(nèi)容

（1）DOM含有的碳比全球海洋和陸地生物量的總和還要多，這一巨大DOM庫的生產(chǎn)和消費過程對于水生生物地球化學循環(huán)和食物網(wǎng)至關重要，因為DOM不僅含有碳，還含有生命其他所必需元素。DOM分子組成在維持其水生系統(tǒng)的長期持久性中起著重要作用，因此，影響水生DOM組成的因素是近年來研究的熱點，揭示了水文過程和氣候因素等環(huán)境變量往往是主要驅動因素。
? ? DOM一個重要特性是高度的分子多樣性，這回阻礙的微生物的周轉，DOM庫由無數(shù)濃度極低的不同分子組成，其中大多數(shù)分子的化學結構未知。DOM中的個別成分可能因為濃度太低不能補償其代謝消耗的利用成本，也無法讓特定的底物分子和能夠利用他們的微生物相遇。除了對DOM持久性的影響，DOM的分子多樣性還具有更廣泛但的生物地球化學意義，例如影響微生物多樣習慣，它們可能共同影響生態(tài)系統(tǒng)的功能（銜接的好好）。然而，因為缺乏傳統(tǒng)地球化學對分子多樣性的關注，關于自然環(huán)境中分子多樣性的進化以及環(huán)境因素如何塑造這種多樣性的的只是有限，只有少數(shù)實驗室培養(yǎng)的實驗提供了這一領域的見解。
? ? 環(huán)境中眾多的來源和反應交織在一起導致解釋這一動態(tài)模式既具有挑戰(zhàn)。最小化混雜因素的一種方法是在這些因素有限的情況下利用簡化的環(huán)境設置。作者所選取的研究地點，在相同的條件下在只有有限的直接人類影響的情況下，是研究不同水化學性質(zhì)的微生物來源的DOM產(chǎn)生和轉化的極好天然培養(yǎng)場景。過去人們?nèi)藶槟蠘O湖泊中DOM bulk整體上的化學特征是相似，因為來源簡單。然而，最近在soya coast附近的47個湖泊中進行的研究解釋了DOM光學活性部分的組成具有相當大的變異性。因此，盡管有機物來源簡單，但不代表這些南極湖泊中的DOM是否表現(xiàn)出高度的分子多樣性，需要確定。
? ? 在此項研究中，作者旨在探究位于地球上最原始和有機物來源有限的環(huán)境之一的湖泊分子多樣性的演變情況，并確定其驅動因素。進一步測試了DOMβ多樣性是否隨著空間距離或環(huán)境的不同而增加。假設空間距離和環(huán)境差異都是DOMβ多樣性的驅動因素，類似于生態(tài)學觀察，光降解在作為長期水停留時間的SOYA附近湖泊形成微生物產(chǎn)生DOM的分子多樣性中起著重要作用。

（2）?結果
南極湖DOM的分子性質(zhì)：α-多樣性
?湖泊的EC范圍非常廣泛，從淡水到高鹽水（>22 S m–1）（圖S1）。湖泊的pH值一般為中性至略微堿性，值范圍為7.15至8.86。我們觀察到EC的DOC呈指數(shù)增加（范圍從0.25到146 mg C L–1），表明隨著EC的增加，湖泊中的原位凈產(chǎn)量和蒸發(fā)濃度增加（圖S1）。在高鹽度海洋遺跡湖泊（圖1中的第3組和第4組）中，我們保守地估計最多只有1.5-7.6%的DOC可能是遺留海洋DOC，因為遺留DOM在自這些湖泊形成以來的數(shù)年大約7000年內(nèi)沒有分解。因此，我們排除了遺留海洋DOM在所有研究湖泊中的貢獻。非常低的分子降解指數(shù) (IDeg) 為0.15 ± 0.03，也支持這些湖泊中的DOM相對年輕的結論。
我們通過FT-ICR MS在SPE-DOM中總共鑒定了9910個獨特的MF。分子豐富度DR，或每個樣本中的MF數(shù)量從2121到6338不等（圖2）。每個樣品的VK圖（O/C與H/C圖）在圖S2中提供。MF數(shù)量的減少與較高的pH和EC有關（圖2）。當考慮協(xié)變變量時，pH、EC 和湖泊表面積都是 DR 的重要預測因子（圖S3）。在冰期湖泊的SPE-DOM樣品中，往往檢測到更多的MF，其中新鮮產(chǎn)生的微生物衍生的生物分子占主導地位。pH值增加約兩個單位對DR有相當大的影響，使其降低一半（從大約6000到3000，圖2）?？紤]其他變量時，EC同樣降低了DR（圖2）。基于豐度的多樣性 DA 同樣隨著 pH 值和 EC 的增加而降低，并且 pH 值、EC、湖面面積和海拔高度是重要的預測因子（圖S3）。全系列功能多樣性DF也隨著EC和pH值的增加而明顯降低（圖2、S4和S5）。

?β-多樣性的驅動因素
?我們使用Mantel測試了空間距離或環(huán)境差異是否可以各自解釋SPE-DOM β多樣性。SPE-DOM β-多樣性，計算為9910個歸一化FT-ICR MS峰強度的Bray-Curtis差異性，范圍在0.08到0.46之間（圖3）。通過β回歸確定了特別負責觀察到的SPE-DOM β多樣性的環(huán)境變量（圖S6）并用于計算整體環(huán)境差異。我們發(fā)現(xiàn)，在我們觀察到的尺度上，空間距離并不是SPE-DOM多樣性的驅動因素（圖3）。相比之下，環(huán)境差異（以標準化（z評分）環(huán)境變量的歐幾里得距離計算）是β多樣性的重要影響因素（圖3）。選擇EC，水溫，pH和DIN濃度的差異性都顯著影響SPE-DOM β多樣性（圖S6）

?基于DOM分子性質(zhì)的湖泊分組
作者通過層次聚類分析確定了如何分組即分組的個數(shù)！
Ⅰ?樣本之間的分子差異通過基于Jensen-Shannon散度 (JSd) 的非度量多維尺度 (NMDS) 在二維空間中表示，該散度比較了稱為DBEAI的分子指數(shù)的頻率分布（參見材料和方法部分）（圖S7）。層次聚類表明，根據(jù)JSd，將樣本分為四組是最合適的（圖S8和S9）。樣品的空間分布如圖1所示。第一個集群 (CL1) 存在于所有區(qū)域，包括所有冰川湖泊，其特征是湖泊和集水區(qū)較小，蒸發(fā)濃度水平較低（如較低的EC、a254、DOC、DIN和DON)，以及相對豐度較高的類腐殖質(zhì)成分和芳香性（通過測量類腐殖質(zhì)熒光成分C500和SUVA254）（圖S7）。第二個集群（CL2）包含高鹽湖以外的湖泊，主要分布在Skarvsnes，也存在于其他地區(qū)（圖1）。第三和第四簇（CL3和CL4）由Skarvsnes的兩個高鹽湖（每個兩個深度）組成，與較大的湖泊和集水區(qū)有關，光降解程度較高（如較高的S275–295），以及表明蒸發(fā)量更大的定量參數(shù)值升高（圖S7）。環(huán)境變量的事后擬合表明，pH值是唯一明確區(qū)分CL1和CL2的特征（圖S7）。因此，F(xiàn)T-ICR MS檢測到CL1和CL2之間的SPE-DOM組成差異，這些差異通過其他水化學特性和體積DOM特性不容易辨別。

Ⅱ我們使用生態(tài)學中常用的IndVal指數(shù)確定了與每個集群特別相關的關鍵MF（圖4）。表S2提供了根據(jù)每個集群的IndVal值選擇作為每個集群指標的MF的摘要。沒有含P的MF作為指標出現(xiàn)。第一個簇CL1（前冰湖）與貧氧（O/C < 0.5）、高度不飽和（AImod ≤ 0.5和H/C < 1.5）、芳香族（AImod > 0.5）富氮和無S的MFs有關。第二個簇CL2僅與無雜原子，高度不飽和的MF相關。第三個簇CL3（高鹽湖Suribachi）富含不飽和（H/C≥1.5）和高度不飽和/芳香MFs。CL3中的高不飽和/芳香族MFs幾乎都含有一個S，而不飽和MFs不含雜原子。第四簇CL4（高鹽湖船佐湖）富含不飽和MFs。CL4的許多不飽和MF含有可變數(shù)量的N和S。圖S10提供了每個簇的指示物種的含S或N的MFs的相對豐度，而質(zhì)量分布，AImod和DBEAI如圖S11所示。每個簇的指標 MF 表現(xiàn)出不同的質(zhì)量和 AImod 分布，盡管后者的差異是預期的，因為用于計算 JSd 的分子指數(shù)是 AImod 的分子。質(zhì)量分布遵循CL2 ～ CL4> CL1 ～ CL3，而AIMOD分布明顯為CL1>CL2>CL3>CL4（圖S11）。MF指標的這些特征與冰川和高鹽湖的范克雷維倫圖一致（圖S12）。僅在冰期湖泊中檢測到的MFs主要是O貧乏、高度不飽和和至少具有12個N的芳香MFs，而在高鹽湖的地表水中獨特的MFs是富含S的不飽和MFs和一些富含S的高度不飽和/芳香MFs（圖S4）。使用條件推理樹（CTree），確定了最能解釋聚類的環(huán)境變量（圖4）。CL3首先被高EC分離，CL1被水溫分離。CL2和CL4通過pH區(qū)分（圖4）。

這個層次聚類分析還挺復雜哈

Ⅲ我們對全部湖泊進行了1H NMR 數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA），以確定FT-ICR MS數(shù)據(jù)上的NMDS數(shù)據(jù)（圖S7）是否充分捕獲了批量DOM的組成差異。我們確認兩個受戒結果的關鍵特征相似；CL1和CL2在排序空間上分離良好，在樣品分布云的邊緣繪制了冰川湖和超鹽湖（圖S13）。具有代表性的DOM NMR波譜如圖S13所示。主成分1（PC1）根據(jù)DOM的微生物處理程度來區(qū)分樣品，其中處理的DOM較多，信號較寬位于PC1的正端，而更“新鮮”，處理較少的DOM，具有來自小生物分子的尖銳信號位于PC1的負端（圖S13）。PC2根據(jù)碳水化合物H的相對豐度分離樣品，富含碳水化合物的DOM與陽性PC2相關，而富含脂肪族或功能化的富含脂肪族的DOM與陰性PC2相關（圖S13）。水的pH值仍然是CL1和CL2與海拔高度之間的區(qū)別因素。DOC、DON和a254等定量參數(shù)再次未能解釋這兩個簇之間的差異。

環(huán)境相異性的計算指標：

討論

（1）DOM α-多樣性的驅動因素：光降解和pH變化
在研究的南極湖泊中，EC和pH分別降低了所有三種類型的SPE-DOM α多樣性（圖2，S4和S5）。這是令人驚訝的，因為其他環(huán)境變量，如水溫和營養(yǎng)物質(zhì)（DIN，PO43–和 SiO32–），可能強烈影響微生物活性的參數(shù)與這些參數(shù)不協(xié)調(diào)。這些湖泊的蒸發(fā)濃縮過程以不同的速率發(fā)生，反映了干旱條件下的普遍蒸發(fā)與集水區(qū)冰雪的淡水輸入之間的平衡。通常，較高的EC值表示凈淡水增益較低，因此保水時間較長。這種較長的保水時間反過來又導致DOM的光降解，如光譜斜率（S275–295）、光降解指數(shù)和EC。我們承認需要謹慎使用S275–295作為光降解指數(shù)，因為它也與有機物來源和分子量的差異有關。然而，對于這個特定的數(shù)據(jù)集，我們先前的研究已經(jīng)證明了它作為光降解指數(shù)的適用性，部分原因是來源簡單，光降解程度的環(huán)境梯度明顯。光降解程度的增加（S275–295）和DOM光學活性部分的芳香族化合物存在明顯的負相關關系（圖S7）。顯然，由于較長的水停留時間，DOM的光降解增強選擇性地減少了吸光，芳香族和/或含雜原子的化合物（圖S12），它沒有減少大量DOC（圖S1）。某些化合物的選擇性降解降低了DR，導致化合物的豐度分布不太均勻和DA減少（圖2），同時它還降低了關于芳香性（H/C、AImod和DBE）的DF（圖2和S4）。DF的范圍與一項為期3年的培養(yǎng)研究中的SPE-DOM數(shù)據(jù)更加接近，該研究中使用了人工海水接種了北海沿海水域的微生物群落，而不是大西洋和南極海域的野外觀測，后者估計DOM的年齡為數(shù)千年，這表明南極湖泊中的DOM處于降解級聯(lián)的初始階段。

??SPE-DOM α多樣性隨著pH值的增加而降低（圖2）可能是由非生物因素引起的。所研究湖泊的弱堿性 pH 值是由于基巖成分主要是輝石或石榴石-黑云母片麻巖。這種基巖的風化釋放出Ca和Mg，導致湖水pH值增加。然而，pH值的變化與其他水成分、湖泊形態(tài)或基巖組成（輝石與石榴石-黑云母片麻巖）無關，可能反映了湖泊中基巖的風化程度。高pH值會導致氧化程度最高的DOM化合物與鐵和鋁氫氧化物共沉淀，從而減少α-多樣性的集合。此外，pH值的增加可以提高DOM的光降解效率，因為羧基和酚基的去質(zhì)子化和/或構象變化，并且可能通過增強光降解導致α多樣性隨著pH值的增加而降低。

（2）?DOM β-多樣性的驅動因素：空間距離與環(huán)境差異
? 令人驚訝的是，有機物源有限的南極湖泊在SPE-DOM分子組成方面非常不同（Bray-Curtis差異范圍為0.08至0.46，平均值為0.25±0.08，圖3）。相比之下，從熱帶到北極的十條世界上最大的河流彼此之間的SPE-DOM在分子上更加相似（0.17±0.06）。一些湖泊之間的SPE-DOM甚至顯示出與河流和深海之間觀察到的差異一樣大的差異（圖3）。在相同氣候下，位于空間有限區(qū)域內(nèi)的湖泊中如何出現(xiàn)如此大的β多樣性？為了解決這個問題，我們首先測試了空間距離與SPE-DOM β多樣性相關的假設。然而，我們觀察到相反的情況；在我們研究的空間尺度上，空間距離對SPE-DOM β多樣性沒有影響。具體來說，來自彼此靠近的湖泊的SPE-DOM與來自遠處湖泊的SPE-DOM在分子上并不相似（圖3）。這一發(fā)現(xiàn)與理論生態(tài)學中的范式相反，該范式認為群落組成相似性預計會隨著距離而降低，反駁我們的第一個假設。SPE-DOM β多樣性與距離之間缺乏顯著關系表明，SPE-DOM的β多樣性可能由不隨距離變化的小規(guī)模環(huán)境異質(zhì)性驅動。這與大多數(shù)湖泊在水文上是脫節(jié)的并且已經(jīng)發(fā)展了數(shù)千年這一事實是一致的。在由周圍環(huán)境（如湖泊形態(tài)、地質(zhì)、小氣候和集水區(qū)內(nèi)的生物活動）隨機決定的湖泊特定設置下。因此，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)境差異（pH、EC、溫度和 DIN）與 SPE-DOM 分子多樣性 (rM = 0.67) 之間存在顯著且強烈的相關性（圖3）。雖然居住在湖泊中的微生物可能在塑造SPE-DOM多樣性方面發(fā)揮重要作用，就像它們在其他水生環(huán)境中一樣，我們?nèi)狈ξ⑸飻?shù)據(jù)來測試這一點。然而，由于微生物組成和功能在很大程度上是由環(huán)境驅動的，環(huán)境差異將成為所研究湖泊中SPE-DOM分子多樣性的強大驅動力。

ps：（Bray-Curits距離值一般在0~1之間，1說明完全不相同，同一個樣本的Bray-Curits一般要求小于0.05）
? ?EC的差異性是影響SPE-DOM β多樣性的最重要參數(shù)（圖S6）。SPE-DOM組成在不同程度的蒸散濃度和光降解下可能出現(xiàn)湖泊差異。水溫（采樣時）是影響第二大的參數(shù)（圖S6）。水溫可能通過微生物活動的變化間接影響SPE-DOM組成，但在我們的數(shù)據(jù)集中，這更可能是由于高鹽湖的特殊水溫（蘇里巴奇湖為12-21°C，富納佐科湖為-3.5至20°C）。以及這些湖泊中不同的DOM分子組成（圖4和S7）。高鹽度海洋遺跡湖泊中的 SPE-DOM 含有高豐度的 S，這可能是由于在水層化引起的缺氧條件下硫化物對 DOM 的非生物硫化作用（圖4和S10）。即使在高鹽湖的地表水中，S的相對豐度也很高，這表明盡管這些湖泊中存在廣泛的光降解，但仍有含S的DOM（DOS）的凈產(chǎn)量。最近提出的DOS的難降解性可能有助于DOM在高鹽湖中的大量積累。在高鹽水湖泊中也觀察到高DIN值，使其成為SPE-DOM β多樣性的明顯驅動因素（圖S6）。水的pH值也對SPE-DOM β多樣性有影響（圖S6）。在冰期湖泊中觀察到較低的pH值，其中SPE-DOM特別富含N（圖4，S10和S12）。冰期湖泊SPE-DOM中氮的富集與先前的發(fā)現(xiàn)一致，即S?ya海岸冰川融水中的DOM富含不穩(wěn)定的含氮化合物。冰期湖泊中氮的相對富集表明，盡管本研究中的所有樣品主要來自微生物，但根據(jù)DOM的“新鮮度”，樣品之間的相對氮豐度可能會有所不同。這些含N的不穩(wěn)定化合物可能在冰川融化后被異養(yǎng)細菌和其他小生物分子迅速消耗，導致產(chǎn)生更復雜的DOM并增強DOM分子多樣性。
? 總之，我們表明SPE-DOM的α和β多樣性都可以僅基于幾個主要水化學參數(shù)來預測（圖2和S3-S6）。此外，我們的結果表明，隨著保水時間的增加和α多樣性隨著EC升高而降低，SPE-DOM的組成在單個湖泊中變得更加獨特，而β多樣性隨著EC差異的增加而增加（即，冰川湖和高鹽湖在SPE-DOM組成方面表現(xiàn)出最大的差異）（圖2和S3-S6）。DOM隨時間推移的分子演替以及由此產(chǎn)生的DOM組成的特異性是湖泊生態(tài)歷史的極好代表。

研究方法

DOM 提取和傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜測量

（1）在用25% HCl酸化 (pH 2) 后，提取DOM并脫鹽用于傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜 (FT-ICR MS) 分析，遵循使用Agilent Bond Elut PPL (100 mg)小柱的既定方法，對以下方面稍作修改。根據(jù)樣品的DOC濃度，對對應于4μmolC的體積進行子采樣。此外，在提取前使用超純水將子樣品稀釋至固定體積（85 mL）。提取相同DOC量和體積的樣品（因此相同的DOC濃度）可最大限度地減少PPL提取DOM期間可能的偽影。將甲醇提取物在黑暗中儲存在-20°C。平均提取效率在DOC基礎上平均為35% ± 10%，與DOM中疏水性組分的相對豐度（% HPO，r = 0.48）呈正相關，而與蛋白類熒光的相對豐度呈負相關（r = -0.68）。相對較低的提取效率，特別是在以蛋白質(zhì)類物質(zhì)為主的湖泊中，表明較新的微生物來源以及所研究湖泊中缺乏對DOM的強烈微生物處理。提取的DOM，以下簡稱固相提取DOM（SPE-DOM），在FT-ICR MS的分析窗口內(nèi)。(為什么在研究方法中寫研究結果？)

（2）我們在15 Tesla solariX XR FT-ICR質(zhì)譜儀（Bruker Daltonik GmbH，不來梅，德國）上對SPE-DOM進行了質(zhì)譜分析，該質(zhì)譜儀配備了負電離模式下的電噴霧電離源（ESI，Bruker Apollo II），和 PAL 自動進樣器。分析前，將提取物在甲醇和超純水 (1:1 v/v) 的混合物中稀釋至終濃度為 2.5 mg C L?1。每個樣品在92-2000 Da的掃描范圍內(nèi)共添加了200個瞬態(tài)，離子累積時間為0.1秒。在提取的每一天，通過與樣品相同的方式處理85 mL pH 2超純水 (0.01 M HCl) 來制備工藝空白提取物。在相同的設置下分析了使用PPL從北赤道太平洋中級水中提取的內(nèi)部參考材料，以測試儀器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。如前所述分配檢測到的質(zhì)量的分子式 (MF)（詳細信息可在S1中找到）?？偣灿?910個MF用于進一步分析。隨后，計算每個配方的修正芳香性指數(shù) (AImod)、降解指數(shù) (IDeg) 以及元素摩爾比。MF 被分為四個描述性化合物類別，即芳香族化合物 (AImod > 0.5)、高度不飽和化合物 (AImod ≤ 0.5 & H/C < 1.5)、不飽和化合物 (H/C ≥ 1.5 & 雙鍵當量，DBE ≠ 0) 和飽和 (DBE = 0) MF。所有四個類別都細分為高氧（O/C ≥ 0.5）和低氧（O/C < 0.5）含量分子式。

分子α和β多樣性：所有統(tǒng)計分析均使用R語言。

Ⅰ作為分子α多樣性的指標，計算了分子豐富度DR、基于豐度的Gini——Simpson指數(shù)（Simpson index of diversity）DA和根據(jù)Mentges等人通過FT-ICR MS分析的功能分子多樣性DF。
①分子豐富度DR被定義為FTICR MS在樣本中鑒定的MF的數(shù)量。DR是DOM分子α多樣性的簡單度量，但是同一樣本的重復測量可能有很大差異。
②DA是使用相對峰度強度分布，該值可以解釋為兩個隨機選擇的分子的MFs不同的概率。該指數(shù)的范圍在0到1之間，其中較大的值表示較高的多樣性。
③DF功能多樣性指標應用于FT-ICR MS數(shù)據(jù)計算為距離函數(shù)（Rao二次熵），使用任何兩個MF之間相對于給定化學性質(zhì)的絕對差值，并按其相對峰值強度加權。DF的值可以解釋為兩個分子之間相對于所選性質(zhì)的預期差異。

在這項研究中，計算功能多樣性與C原子數(shù)作為分子量指標，H/C最為飽和度指標，N/C作為相對氮豐富度的指標，AImod和DBE最為DOM芳香性的指標，碳的標稱氧化態(tài)NOSC最為與化合物反應性相關的MF平均氧化態(tài)的指標。隨著NOSC的增加，有機化合物的氧化在熱力學上變得更加有利可圖。

Ⅱ分子β多樣性計算：Jensen-Shannon差異 (JSd) 是遺傳學和信息論中使用的一種差異，用于計算樣本之間的分子β多樣性（差異）。。JSd比較樣本之間所選MF特性的頻率分布（即未使用強度信息），并且在計算中使用二進制對數(shù)時限制在0和1之間。例如，這些特征可以是化合物類別的相對頻率或MF派生指數(shù)（如DBEAI）的分布。DBEAI是AImod的分子，在從原始MF中減去所有可能通過碳和雜原子之間的鍵貢獻DBE的官能團后，計算為所得分子核的DBE。由于 DBEAI 以 0.5 間隔自然分箱，因此可以從樣本中輕松計算每個分箱的經(jīng)驗概率，因此 DBEAI 優(yōu)于 AImod 用于 JSd 計算并在此處使用。此外，我們發(fā)現(xiàn)基于DBEAI的JSd實現(xiàn)了更好的聚類（具有負輪廓值的樣本更少）并且比基于相對峰強度的經(jīng)典 Bray-Curtis 差異識別出更有意義的指示物種。
? ? 對于下面描述的Mantel測試，SPE-DOM的分子β多樣性計算為9910標準化FT-ICR MS峰強度的Bray-Curtis差異性，這允許與先前使用Bray-Curtis差異的研究直接比較。將每個樣品的峰強度歸一化為該樣品的峰強度總和。
? ??我們注意到，任何基于MFs或峰強度的DOM分子多樣性測量都低估了其真正的分子多樣性，因為給定的MF或峰背后有許多異構體。然而，使用當前的分析技術，不可能得出數(shù)據(jù)集中所有MF的化學結構。MF方法是實用和保守的，可以很容易地用于計算研究中的多樣性指數(shù)。

統(tǒng)計分析：
Ⅰ基于 JSd 執(zhí)行非度量多維尺度 (NMDS) 和具有平均鏈接凝聚聚類的層次聚類。通過最大化輪廓系數(shù)以及相異矩陣和表示組分配的二元矩陣之間的比較，找到了最佳聚類數(shù)。外部變量被事后擬合到 NMDS 排序空間，p 值計算超過 9999 個排列。使用指示物種值（IndVal）計算每個簇的MF特征，預定義組中MF的相對頻率和相對平均豐度的乘積（在本例中為聚類）。當在單個聚類中找到給定的MF并且在該集群中的所有湖泊中找到MF時，該指數(shù)最大（即1）。指標值的統(tǒng)計顯著性通過9999個排列進行了檢驗。針對多次測試調(diào)整每個MF的排列p值，調(diào)整后的 p 值≤ 0.05 被認為是顯著的。計算每個簇的平均化學性質(zhì)，包括MFs中的氮和硫含量，質(zhì)量，AImod和DBEAI可以解釋聚類的環(huán)境變量由條件推理樹（CTree）標識（圖4）。CTree 在探索變量（環(huán)境變量）的閾值處使用重復的二進制數(shù)據(jù)拆分，以便最大化聚類之間的分離。
Ⅱ?我們還進行了PCA 1H NMR數(shù)據(jù)，以評估FT-ICR MS數(shù)據(jù)上的NMDS是否充分捕獲了大量DOM組成差異。這一點尤其重要，因為FT-ICR MS是在相對較小的PPL提取DOM（SPE-DOM）上進行的。以 0.005 ppm 的分辨率（每個樣品 780 個數(shù)據(jù)點）為每個樣品導出 0.5–4.4 ppm 的 NMR 光譜信號強度。由于大多數(shù)樣品中缺乏信號，因此未包括芳香族信號區(qū)域。PCA是在將NMR數(shù)據(jù)縮放到單位方差（即相關矩陣）之后進行的，否則來自小分子的尖銳信號將主導負載。與 NMDS 中一樣，環(huán)境變量是事后擬合的。
Ⅲ?測試了空間距離和環(huán)境差異是否可以分別解釋SPE-DOM的分子β多樣性。通過Mantel檢驗評估了這些因素對SPE-DOM β多樣性（Bray-Curtis差異）的影響。該檢驗比較為相同對象計算的兩個相似/相異矩陣，并檢驗有關它們之間關系的假設。在這里，我們測試了SPE-DOM的β多樣性隨空間距離或環(huán)境差異而增加的假設。湖泊之間的空間距離計算為球體上湖泊之間的大圓距離，給定它們的經(jīng)度和緯度。環(huán)境差異性計算為標準化（z score）環(huán)境變量的歐氏距離。Mantel 統(tǒng)計量 (rM) 是兩個相異矩陣的條目之間的 Pearson 相關性，是在對每個矩陣中的值進行標準化之后得出的。Mantel統(tǒng)計量的重要性通過9999個排列進行了檢驗。使用貝葉斯信息準則（BIC）選擇用于Mantel測試的環(huán)境變量對于beta回歸模型以Bray-Curtis相異性作為響應變量，將z評分環(huán)境變量之間的歐幾里得距離作為解釋變量。此外，我們估計了BIC選擇的環(huán)境變量對Bray-Curtis差異的部分影響。我們還以同樣的方式估計了BIC選擇的環(huán)境變量對α多樣性的部分影響。