前段時間，小源為大家整理了一份CRISPR文庫的新手攻略，里面提到了CRISPR文庫的應用（可點擊回顧>>CRISPR文庫火“出圈”啦！還不會用？這篇給你從頭到尾梳理一遍！），今天就給大家分享一個CRISPR文庫用于藥物靶點篩選的案例，希望能幫助大家更好地了解如何使用CRISPR文庫！

胃癌是全球第五大常見癌癥類型，也是死亡率第三高的腫瘤類疾病。雖然目前胃癌的早期診斷、手術、化療及放療等系統(tǒng)性治療研究已取得巨大進展，但目前胃癌治愈存活率仍很低，近5年生存率僅在30%左右。因此尋找新的藥物靶點、研發(fā)療效更好的靶向藥物迫在眉睫。

Zeng等人CRISPR敲除文庫對胃癌細胞（Gastric Cancer Cell，GCC）的全基因組進行篩選，發(fā)現(xiàn)了184個新確立的必需基因、確定了41個必需基因為潛在藥物靶點，進一步研究后證實METTL1為胃癌的潛在治療靶點。具體研究思路如下：

使用CRISPR文庫對AGS細胞系進行全基因組篩選并評估結果可靠性

通過對Achilles、Sanger兩個數(shù)據庫中的GC樣本進行相關系數(shù)比較分析，研究人員得到7個重疊的GC細胞系（見圖S1），并發(fā)現(xiàn)必需關鍵基因定義一旦變更，這7個重疊GC細胞系的關鍵必需基因數(shù)據庫間相關性將反轉：Achilles定義的1969個關鍵必需基因在這兩個數(shù)據庫間表現(xiàn)出較強相關性，而Sanger定義的525個關鍵必需基因在這兩個數(shù)據庫間的相關性較弱或不相關（見圖S1C和圖S2C）。

因此，研究人員決定使用CRISPR文庫來為確定GC細胞的關鍵基因及治療靶點提供證據支持。他們采用三質粒體系通過脂質體法將TKOv3文庫轉染進293T細胞中進行病毒包裝。接著使用病毒感染AGS細胞，通過嘌呤霉素篩選出轉染成功的AGS細胞系。提取第0天、第10天以及第20天的對照組細胞（未施加壓力的）的DNA進行深度測序對比后，他們發(fā)現(xiàn)基因缺失的數(shù)量隨代數(shù)的增加而增加（見圖1C），結合Wilcoxon秩和檢驗結果確認該篩選已順利完成。

接著，研究人員應用MAGeCKFlute算法及RRA評分確認了854個AGS細胞系的必需基因，并為這些基因建立了一個新的數(shù)據庫。經Pearson相關系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，這個新數(shù)據庫的基因與Achilles、Sanger數(shù)據庫的必需基因相關性很高，且通過對比TKOv3文庫Moffat的關鍵必需基因和非必需基因列表對RRA評分排序的基因進行評估的曲線下面積為0.993（圖1I），這些結果都表明CRISPR文庫篩選的結果可靠性很高。

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探索必需基因的功能

而后，通過對篩選結果進行分析，他們發(fā)現(xiàn)第10天和第20天的篩選出的必需基因中有689個是相同的。接著他們使用GO生物學功能富集分析對每個時間點的所有必需基因的功能進行研究，找出了最密切相關的10個功能（圖2B），并發(fā)現(xiàn)第10天分析結果僅能說明必需基因與維持核糖體和RNA正常功能密切相關，而第20天的分析結果則能具體到血紅素合成過程、細胞藥物響應等功能（圖2E）。這說明CRISPR文庫篩選結果是可靠的，且延長篩選時間可以摸清必需基因的具體功能。

研究人員對篩選結果中的9個必需基因和1個非必需基因進行分析，發(fā)現(xiàn)只有SNRPB和TOP3A的sgRNA作用不盡一致，其他7個基因的sgRNA都對細胞活性表現(xiàn)出一致作用（圖3A）。在AGS細胞中建立這10個基因的敲低細胞模型以研究這些基因對細胞活性的影響（圖3B）。ALamar Blue檢測結果顯示，敲低非必需基因RNASET2不會影響細胞活性及細胞集落數(shù)量，而敲低必需基因細胞活性會下降、細胞集落數(shù)量會減少（圖3D、E），這也驗證了篩選出的基因確實為AGS細胞存活所必需。

在這9個必需基因中，CIT和TACC3先前并未被Achilles和Sanger數(shù)據庫納為必需基因，但它們確實與維持細胞活性密切相關。這樣的基因TKOv3文庫篩選結果中還有182個。因此，這184個新發(fā)現(xiàn)的必需基因填補了Achilles、Sanger數(shù)據庫的某些空白。不僅如此，研究人員還發(fā)現(xiàn)與TCGA數(shù)據庫中正常胃粘膜組織相比，胃腺癌（GAC）組織中的這9個基因表達均上調（圖3G），提示文庫篩選出的必需基因或為癌癥治療潛在藥物靶點。

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從必需基因中篩選出潛在藥物靶點

為了篩選出具有特異性的潛在藥物靶點，研究人員首先去除了關鍵必需基因，僅保留AGS細胞系的特異性必需基因。接著使用PMA MAS 5.0剔除AGS細胞系中TCGA-STAD顯示低表達的基因，比較剩余的TCGA-STAD差異表達基因，確認了GAC組織中上調的41個必需基因為潛在藥物靶點（圖4A），其中包括上述提及的CIT、TACC3、MTBP。

敲除AGS細胞中的METTL1以驗證篩選策略有效性

與CIT、TACC3一樣，tRNA N7-m7G甲基轉移酶（METTL1）基因并未被Achilles、Sanger收錄為必需基因，卻在CRISPR文庫篩選中被認定為必需基因的基因。為進一步驗證METTL1對GC細胞系生物學功能的影響，研究人員設計了三種針對METTL1的siRNA，建立了METTL1 AGS敲低細胞系。METTL1-siRNA2和METTL1-siRNA3的敲低分別導致細胞存活率下降22.46%、數(shù)量下降27.09%（圖4D），CCK8實驗結果表明細胞活力以siRNA劑量和時間依賴的方式下降（圖4E、F），集落形成分析實驗中也發(fā)現(xiàn)敲低METTL1會導致細胞集落數(shù)量銳減77.82%（圖4G）。這些都說明METTL1基因對AGS細胞的存活而言至關重要，是AGS細胞的必需基因，該結論與之前的實驗結果一致，從正面證明了CRISPR文庫篩選策略的有效性。

而后，研究人員使用同樣的方法對METTL1在其他GAC細胞系中的作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)METTL1可能對多個GAC細胞系的增殖都有影響（圖4K）。

進行METTL1體內敲低實驗驗證METTL1是否是潛在藥物靶點

將轉染了METTL1-siRNA或NC-siRNA的MKN45細胞通過皮下注射至BALB/c裸鼠體內，形成皮下腫瘤。在第20天對腫瘤的體積、重量進行測量，發(fā)現(xiàn)METTL1敲低組的腫瘤平均體積和重量較對照組腫瘤的分別低55.19%和55.97%。說明敲低METTL1可以有效抑制腫瘤的生長，METTL1可為胃癌治療的藥物靶點。

探究METTL1在GC細胞系中的作用及作用機制

對METTL1敲低的GC細胞的細胞周期進行研究發(fā)現(xiàn)，敲低METTL1后細胞周期標志物CDK1的水平也顯著下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低METTL1將顯著下調AKT和STAT3水平（圖6），提示METTL1可能通過激活AKT/STAT3/CDK1信號通路在細胞周期中發(fā)揮作用。

最后，研究人員還對GEO、TCGA數(shù)據庫中的臨床樣品數(shù)據進行分析，發(fā)現(xiàn)與正常胃粘膜組織相比，GAC組織中的METTL1 mRNA確實是過表達的，且隨著腫瘤分期的遞增，METTL1 mRNA的表達逐漸增加，這表明METTL1可能是一個有效的抗腫瘤藥物靶點。

該研究發(fā)現(xiàn)了184個新確立的AGS細胞系必需基因、確定了41個潛在藥物靶點，驗證了METTL1在腫瘤細胞發(fā)展中的作用，呈現(xiàn)了一個完整的CRISPR文庫篩選思路：從用CRISPR gRNA文庫感染細胞、細胞篩選、DNA測序到基因功能驗證！

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