細胞染色體核型分析

2022-04-27 10:18 作者:Cas9X海星生物 0人讀過 | 我要投稿

試劑配置

秋水仙堿（秋水仙素Colchicine）：

原液濃度5 mg/mL，2~8℃避光保存原液，保質(zhì)期約一年。

作用：秋水仙素可與微管蛋白二聚體結(jié)合，防止微管蛋白轉(zhuǎn)換，破壞紡錘體，抑制有絲分裂，使染色體停滯在分裂中期，從而獲得大量分裂相。

防護：秋水仙素有劇毒，但無揮發(fā)性，操作時做好個人防護，廢液要倒入指定處，不可隨意丟棄。

低滲液0.075 mol/L KCl：

配制：稱取2.794 g KCl（AR），加蒸餾水至500 mL，充分溶解，常溫保存。

作用：利用細胞膜的滲透作用，使細胞吸水膨脹，便于制片時細胞破裂，獲得分散良好的染色體分裂相。

卡諾氏固定液（Carnoy固定液）：

配制：甲醇：冰乙酸=3：1，現(xiàn)用現(xiàn)配，長時間放置會產(chǎn)生酯化反應，生成乙酸甲酯，影響固定效果。

作用：能迅速穿透細胞，固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，增強染色體的嗜堿性，達到優(yōu)良染色效果。

防護：甲醇具有毒性，吸入過量或飲用會在肝內(nèi)代謝，經(jīng)醇脫氫酶作用氧化成甲醛，進而氧化成甲酸。冰醋酸無毒性，但有刺激性和腐蝕性。實驗時需在通風櫥中操作，并做好個人防護。

吉姆薩染液（姬姆薩染液、Giemsa染液）：

配制：3 mL Giemsa染色原液，1 mL丙酮與48.5 mL Gurr Buffer，現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：使用次數(shù)過多會減弱染色效果，建議控制在5次內(nèi)。

0.25％胰酶溶液：

作用：Matsukuma用專門與蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光染料丹磺酰氯（dansyl-cl）染胰酶處理過的染色體，發(fā)現(xiàn)有明暗帶紋，帶型與G帶一致。帶區(qū)熒光強，非帶區(qū)熒光暗，為此證明胰酶處理使非帶區(qū)的蛋白質(zhì)丟失，而帶區(qū)蛋白仍保留。

操作流程

染色體核型分析是以分裂中期染色體為研究對象，根據(jù)染色體的長度、著絲點位置、長短臂比例、隨體的有無等特征，并借助顯帶技術對染色體進行分析、比較、排序和編號，根據(jù)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異情況來進行診斷。核型分析可以為細胞遺傳分類、物種間親緣的關系以及染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的研究提供重要依據(jù)。

1. 秋水仙素處理：

a. 倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，培養(yǎng)至細胞生長旺盛，匯合度約70-80%左右時收獲。

b. 收細胞前2.5小時，向培養(yǎng)基內(nèi)加入秋水仙素，使得終濃度為0.2 μg/mL。

c. 常規(guī)操作消化收集細胞至15mL帶尖端的離心管內(nèi)備用。

2. 低滲：

a. 在37度水浴箱中充分預熱0.075mol/L KCL低滲液。

b. 常規(guī)操作離心細胞，去上清留下細胞沉淀，并加入8mL預熱的低滲液，使用玻璃吸管吹打，充分混勻。

c. 加蓋并置于37度水浴箱中，計時15 min。

d. 常規(guī)離心后，使用玻璃吸管移除上清，留下約0.5mL體積的殘液，以免損失細胞。

3. 固定：

a. 輕輕刮動離心管底部，利用輕微震蕩讓膨脹的細胞沉淀重懸，可見懸液成為較為均勻的淡白狀。

b.?預固定：沿著管壁滴加新鮮配制的固定液，邊滴加邊輕晃管身使其充分混勻，添加約1mL固定液，固定5min。

c. 常規(guī)轉(zhuǎn)速離心10min，使用玻璃吸管棄去上清，留約0.5mL體積的殘液。

d.?第一次固定：輕微震蕩讓底部細胞重懸，加入固定液5mL，使用玻璃吸管輕柔吹打數(shù)次即可。加蓋避光，室溫放置30min。

e. 常規(guī)轉(zhuǎn)速離心10min，使用玻璃吸管棄去上清，留約0.5mL體積的殘液。

f.?第二次固定：輕微的震蕩讓底部細胞重懸，加入固定液5ml，使用玻璃吸管輕柔吹打數(shù)次即可。加蓋避光，室溫放置30min。

g. 常規(guī)轉(zhuǎn)速離心10min，使用玻璃吸管棄去上清，留約0.5mL體積的殘液。

h. 輕微震蕩讓底部細胞重懸，形成細胞懸液。

4. 制片：

將玻片用酒精擦拭后晾干備用，使用時用鑷子確定磨砂面為載玻片的正面。整個過程中，要避免手指接觸以防在非磨砂區(qū)表面留下指印。

吸取少量（一般為100 μL）細胞懸液，懸空在30-40 cm高處將懸液逐步滴加到載玻片上，并盡量避開已滴加過的區(qū)域。

滴加完畢，立即在酒精燈的火焰下迅速過火固定幾次，固定液揮發(fā)，玻片上會看到明顯的細胞顆粒。標記樣品相關內(nèi)容并放置于玻片架晾干。

細胞密度以細胞不重疊，滴片后低倍鏡下每視野100-200個細胞為宜。滴片后無需染色，可置于倒置相差顯微鏡下觀察分裂相情況。

5. G顯帶染色：

a. 取2.5％胰酶溶液5mL，加入染色缸中，加入45mL生理鹽水，用HCl或NaOH及酚紅調(diào)節(jié)胰酶溶液成紫紅色（pH6.8～7.2），置 37℃預溫。

b. 玻片標本放入胰酶溶液中處理20～25 s，不斷輕輕搖動玻片，使胰酶作用均勻。取出染色體玻片標本，置于37℃預溫的生理鹽水中涮洗片刻。立即放入37℃預溫的Giemsa染液中，染色10min，用洗瓶（純水）沖洗并用吹風機開啟冷氣流吹干。

備注：取3 mL Giemsa染色原液，1 mL丙酮與48.5 mL Gurr Buffer，配制Giemsa 染色應用液。

6. 分裂相拍照分析：

a. 低倍鏡下找到分裂相，選分散良好、染色體輪廓清晰的單個細胞（分裂相）

選擇標準：①分裂相需完整獨立，染色體不過于松散，周圍無其他距離很近的分裂相。②染色體形態(tài)適中，不過度短小或纖長，染色體彼此間無交聯(lián)纏繞或者交聯(lián)的染色體能明確的區(qū)分。③染色體G顯帶普遍較清晰，檢測人員能夠精確的判斷染色體號別。

b. 將準備觀察的目的物移至視野正中央，依次轉(zhuǎn)換到高倍鏡、油鏡下觀察。

c. 計數(shù)染色體個數(shù)，記錄檢測結(jié)果。