1、引物最好在模板cDNA 的保守區(qū)內(nèi)設計

DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。

2、引物長度一般在15~30 堿基之間

引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。

3、引物GC 含量在40%~60%之間，

Tm 值最好接近72℃

GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm 值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。

4、引物3′端要避開密碼子的第3 位

如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。

5、引物3′端不能選擇A，最好選擇T

引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A 時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T 時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C 錯配的引發(fā)效率介于A、T 之間，所以3′端最好選擇T。

6、堿基要隨機分布

引物序列在模板內(nèi)應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。

7、引物自身及引物之間不應存在互補序列

引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4 個堿基的互補。

兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer 與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4 個堿基的互補。

引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應盡量使其△G 值不要過高（應小于4.5kcalmol）。否則易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。

8、引物5′ 端和中間△G 值應該相對較高，

而3′ 端△G 值較低

△G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，△G 值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應當選用5′ 端和中間△G 值相對較高，而3′ 端△G 值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應。（不同位置的△G 值可以用Oligo 6 軟件進行分析）

9、引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾

引物的5′ 端決定著PCR 產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA 序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。

引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。

10、擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)

某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA 的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G°）小于58.6l kJmol 時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP 取代dGTP 對擴增的成功是有幫助的。

11、引物應具有特異性

引物設計完成以后，應對其進行BLAST 檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。

值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC 含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。