CRISPR-Cas系統(tǒng)的RNA編輯神器——Cas13
一直以來?RNA 水平的核酸編輯被認為是一種治療遺傳疾病的有效技術，可以挽救與疾病相關的序列以產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)產(chǎn)品，是熱點所在。近年來研究正熱的Cas13蛋白在crRNA的引導下可以特異性編輯RNA。今天小恒給大家整理的正是關于Cas13的作用機制及應用現(xiàn)狀，供大家參考。
CRISPR-Cas13系統(tǒng)屬于Type VI家族，包括Cas13a、b、c、d等多個亞型。Cas13蛋白都是由多結構域組成的單一蛋白，具有識別crRNA、切割RNA、甚至是切割pre-crRNA的功能。Cas13蛋白具有2個標志性的HEPN結構域，2個R-XXXX-H保守基序是HEPN結構域的核酸酶活性位點。除了Cas13蛋白外，Type VI家族基因位點上還包含CRISPR array。CRISPR array由重復序列（Repeat）和間隔序列（spacer）組成，CRISPR array轉錄形成未成熟的pre-crRNA，經(jīng)切割形成成熟的crRNA，引導Cas13蛋白發(fā)揮功能。
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CRISPR/Cas13系統(tǒng)功能機制：
與CRISPR-Cas9/12系統(tǒng)一樣，CRISPR-Cas13系統(tǒng)在其天然宿主中的作用機制包括適應、表達和干擾。在表達階段，產(chǎn)生crRNA和效應核酸酶。CRISPR陣列被轉錄為前crRNA轉錄本，該轉錄本由Cas13的REC葉加工成crRNA。與II型Cas9不同，它不需要反式激活(tracr)RNA或內(nèi)源性RNase?H。而且，pre-crRNA相對于II型具有簡單的結構。DR區(qū)域形成一個發(fā)夾，兩側有大約20-30nt間隔序列，間隔序列為50（VI-B、VI-X和VI-Y）或30（VI-A、VI-C和VI-D）。crRNA內(nèi)的間隔區(qū)對特定靶RNA具有特異性，并介導其識別。處理后，成熟的crRNA包含DR和間隔區(qū)。在靶標RNA被Cas13:crRNA復合物識別并結合之前，基本不具備裂解活性。與靶RNA形成三元復合物后，構象重排隨之發(fā)生，從而使crRNA：靶RNA雜交體完全被核酸酶核心包圍，并且催化激活核酸酶。在crRNA內(nèi)，可以識別一些子區(qū)域，其中之一是種子區(qū)域。它與靶RNA的完美互補性對于靶RNA的有效結合和切割至關重要。與Cas9不同的是，Cas13蛋白不需要PAM序列來識別其靶標，但對臨近基序區(qū)域兩側表現(xiàn)出核苷酸偏好，并將其稱為ProtSpacer側翼(PFS)。推薦設計Cas13系統(tǒng)gRNA的在線網(wǎng)站：CHOPCHOP，（http://chopchop.cbu.uib.no）。
Cas13蛋白功能非常重要的另一機制是在靶識別時，Cas13：crRNA不僅會切割目標RNA，而且會非特異性切割附近存在的RNA，這一機制與上一期講的Cas12蛋白非常相似，被稱為反式切割。因此，它還可以降解鄰近的其他RNA。與DNA靶向系統(tǒng)不同，Cas13a不會摧毀入侵者，而是通過引起強大的反式切割效應誘導細胞休眠，從而導致宿主的非特異性免疫，從而防止病原體進一步傳播。
CRISPR-Cas13系統(tǒng)的應用：
1、核酸檢測：CRISPR-Cas13系統(tǒng)與crRNA、底物結合形成三元復合體后，Cas13蛋白被激活，此時Cas13蛋白不僅能切割底物RNA，還能切割游離在環(huán)境內(nèi)的任意單鏈RNA，即反式切割現(xiàn)象。在反應體系中加入大量信號報告分子，該分子一端連有熒光基團，另一端連有猝滅基團，正常情況下報告分子不發(fā)出熒光。當Cas13蛋白-crRNA二元復合體識別底物RNA后，Cas13蛋白被激活，除了特異性地切割底物RNA，還會非特異性地切割環(huán)境內(nèi)的報告分子，釋放信號。
圖3?SHERLOCK檢測原理示意圖，圖片來源Kellner MJ al?et, 2019
2、RNA成像：研究人員對Cas13蛋白HEPN結構域R-XXXX-H基序進行突變，得到dCas13蛋白。dCas13蛋白喪失切割酶活性，但保留了結合酶活性，因此能夠靶向目標RNA分子。目前有3種基于CRISPR-Cas13系統(tǒng)的RNA成像工具：Broad研究所張鋒團隊研發(fā)的dLwaCas13a-msfGFP融合蛋白、用于LncRNA失蹤的dPspCas13b-EGFP、進行活體轉錄本成像的CRISPR Live FISH技術。
3、轉錄組調(diào)控：在dCas13蛋白上融合各種效應蛋白，能夠實現(xiàn)各種針對RNA的調(diào)控：m6A甲基化調(diào)控，如dCas13-METTL3和dCas13-METTL3/METTL14融合蛋白，可實現(xiàn)特定位點的RNA甲基化。dCas13-ALKBH5融合蛋白，實現(xiàn)特定位點RNA去甲基化。
CRISPR/Cas13系統(tǒng)對于研究重要基因、基因特定轉錄本、非編碼RNA、RNA堿基修飾等至關重要，擁有極大的研究前景，目前學者們對Cas13酶的探索仍在不斷進行中。漢恒專營工具病毒十余載，可定制各種質(zhì)粒以及病毒工具，如有技術問題或產(chǎn)品訂購需求，歡迎隨時咨詢！
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