活體成像技術(shù)是指應(yīng)用影像學(xué)方法，在不損傷動(dòng)物的前提下，對(duì)活體狀態(tài)下的生物過(guò)程進(jìn)行組織、細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究的技術(shù)。通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)可以非侵入式、直觀地觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移、疾病的發(fā)展過(guò)程、基因的表達(dá)變化等生物學(xué)過(guò)程。與傳統(tǒng)剝瘤稱重測(cè)量的方法相比，活體成像能夠?qū)ν环N實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，跟蹤同一觀察目標(biāo)(標(biāo)記細(xì)胞及基因)，數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信，成本更低，靈敏度更高。

目前活體成像技術(shù)主要采用生物發(fā)光(Bioluminescence)與熒光(Fluorescence)兩種技術(shù)，生物發(fā)光技術(shù)是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或者DNA，而熒光技術(shù)則是應(yīng)用熒光蛋白(如GFP,RFP,Mcherry等)標(biāo)記細(xì)胞或是蛋白等研究對(duì)象。其中生物發(fā)光技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)靈敏，在腫瘤，分子互作及信號(hào)傳導(dǎo)等研究中得到了廣泛應(yīng)用。

什么是LUC

熒光素酶(Luciferase)是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是來(lái)自北美螢火蟲(chóng)(Photinus pyralis)體內(nèi)的熒光素酶。螢火蟲(chóng)熒光素酶屬于加氧酶(oxygenase)，其發(fā)光反應(yīng)需要O2和Mg2+參與;有輔酶A(CoA)存在時(shí)能提高反應(yīng)效率，增加發(fā)光時(shí)間。螢火蟲(chóng)熒光素酶無(wú)需翻譯后修飾，即可表現(xiàn)出熒光素酶活性。將螢火蟲(chóng)熒光素酶的基因插入慢病毒介導(dǎo)的載體中，通過(guò)CAG啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)從而作為報(bào)告基因，在細(xì)胞中表達(dá)。常用于細(xì)胞標(biāo)記后小動(dòng)物細(xì)胞移植活體成像追蹤，從而評(píng)估移植后細(xì)胞的歸巢以及治療效果等。

什么是GFP

綠色熒光蛋白1962年在一種學(xué)名Aequoreavictoria的水母中發(fā)現(xiàn)。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色螢光。這個(gè)發(fā)光的過(guò)程中還需要冷光蛋白質(zhì)Aequorin的幫助，且這個(gè)冷光蛋白質(zhì)與鈣離子(Ca2+)可產(chǎn)生交互作用。將綠色熒光蛋白的基因插入慢病毒介導(dǎo)的載體中，通過(guò)flap-Ub啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)從而作為報(bào)告基因，在細(xì)胞中表達(dá)。常用于細(xì)胞標(biāo)記后移植追蹤，從而評(píng)估移植后細(xì)胞的歸巢以及治療效果等。

什么是RFP

紅色熒光蛋白，目前使用的是 mCherry一種來(lái)自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的紅色熒光蛋白，常有于標(biāo)記和示蹤某些分子和細(xì)胞組分。相對(duì)于其他熒光，mCherry的好處在于它的顏色和應(yīng)用最多的綠色熒光蛋白(GFP)能進(jìn)行共同標(biāo)記，并且mCherry相對(duì)于其他單體熒光蛋白來(lái)說(shuō)也具有卓越的光穩(wěn)定型。本產(chǎn)品將紅色熒光蛋白的基因插入慢病毒介導(dǎo)的載體中，通過(guò)flap-Ub啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)從而作為報(bào)告基因，在細(xì)胞中表達(dá)。常用于細(xì)胞標(biāo)記后移植追蹤，從而評(píng)估移植后細(xì)胞的歸巢以及治療效果等。

小動(dòng)物活體成像技術(shù)原理

1. 標(biāo)記原理

哺乳動(dòng)物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源(腹腔或靜脈注射)給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。對(duì)于細(xì)菌，lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成，帶有這種操縱子的細(xì)菌會(huì)持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。

1.1.生物發(fā)光成像系統(tǒng)組成

體內(nèi)可見(jiàn)光成像系統(tǒng)主要由三局部組成

[1] CCD鏡頭：選擇適當(dāng)?shù)腃CD鏡頭，對(duì)于體內(nèi)可見(jiàn)光成像是非常重要的。

[2] 成像暗箱：像暗箱屏蔽宇宙射線及一切光源,可以使暗箱內(nèi)部保持完全黑暗，CCD所檢測(cè)的光線完全由被檢動(dòng)物體內(nèi)發(fā)出，防止外界環(huán)境的光污染。

[3]軟件系統(tǒng)：軟件系統(tǒng)負(fù)責(zé)儀器控制和圖像分析。

1.2.標(biāo)記細(xì)胞的方法

通過(guò)分子生物學(xué)克隆技術(shù),將熒光素酶的基因插到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，通過(guò)單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株。

1.3結(jié)果觀察

將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)后,觀測(cè)前需要注射熒光素酶的底物一熒光素,為約280道爾頓的小分子。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30-45分鐘。應(yīng)用一個(gè)高度靈敏的制冷CCD相機(jī)及特別設(shè)計(jì)的成像暗箱和成像軟件。

2. 光學(xué)原理

光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過(guò)組織和皮膚而被檢測(cè)到。在相同的深度情況下, 檢測(cè)到的發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系?？梢?jiàn)光體內(nèi)成像技術(shù)的基本原理在于光可以穿透實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織并且可由儀器量化檢測(cè)到的光強(qiáng)度，同時(shí)反映出細(xì)胞的數(shù)量。

2.1. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

通過(guò)分子生物學(xué)克隆技術(shù), 應(yīng)用單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶蛋白的細(xì)胞株。

2.2.熒光成像功能

熒光發(fā)光是通過(guò)激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白DsRed 及其它熒光報(bào)告基團(tuán)，標(biāo)記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費(fèi)用低廉和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。同生物發(fā)光在動(dòng)物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性要好得多，近紅外熒光為觀測(cè)生理指標(biāo)的最佳選擇。

雖然熒光信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來(lái)研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像。但是，熒光成像有其方便，便宜，直觀，標(biāo)記靶點(diǎn)多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點(diǎn)，在一些植物分子生物學(xué)研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對(duì)于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的方法。最近許多文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)中，利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行雙重標(biāo)記，用成熟的熒光成像技術(shù)進(jìn)行體外檢測(cè)，進(jìn)行分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究;然后利用生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)，進(jìn)行活體動(dòng)物體內(nèi)研究。

小動(dòng)物活體成像常見(jiàn)問(wèn)題及分析

1.熒光素酶的發(fā)光是否需要激發(fā)光?

熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素(Luciferin)。

2.在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，為什么要經(jīng)常用抗生素篩選?

體外培養(yǎng)過(guò)程中，不篩選也可以，只要時(shí)間不是很長(zhǎng)， 接種代數(shù)不要很多。到目前為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因丟失的情況。但若接種的代數(shù)過(guò)多，建議用藥物篩選一段時(shí)間或從原始的細(xì)胞株培養(yǎng)以保證細(xì)胞發(fā)光的強(qiáng)度，廈門逸漠生物的LUC 、GFP 、RFP及雙標(biāo)記使用puro、bsd抗性篩選。

3.底物熒光素(Luciferin)是如何進(jìn)入小鼠體內(nèi)的?需要多少?

熒光素是腹腔注射或尾部靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)的，約一分鐘就可以擴(kuò)散到小鼠全身。常用方法是腹腔注射，擴(kuò)散較慢，開(kāi)始發(fā)光慢，持續(xù)發(fā)光長(zhǎng)。若進(jìn)行熒光素靜脈注射，擴(kuò)散快，開(kāi)始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時(shí)間很短。大部分發(fā)表的文章中，熒光素的濃度是150mg/kg 。20克的小鼠約需3mg的熒光素。

4.熒光素酶的發(fā)光特性如何?

通過(guò)腹腔注射老鼠后約一分鐘左右熒光素酶就開(kāi)始發(fā)光，通常十分鐘后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的最高點(diǎn)。在最高點(diǎn)通常持續(xù)約20-30分鐘后開(kāi)始衰減，約三小時(shí)后發(fā)光全部消失。通常最好的檢測(cè)時(shí)間是在注射后15 - 35分鐘之間，但建議實(shí)驗(yàn)人員在做不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ颓斑M(jìn)行連續(xù)時(shí)間點(diǎn)發(fā)光曲線的繪制，以確定最高穩(wěn)值的時(shí)間范圍。

5. 如何保證熒光素酶(Luciferase)的穩(wěn)定性?

熒光素酶基因是插到細(xì)胞染色體上的，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí), 熒光酶也會(huì)得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。

6. 標(biāo)記的腫瘤接種以后，會(huì)發(fā)生 Luciferase 的丟失嗎?

丟失的可能性及量非常小，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有一些實(shí)驗(yàn)報(bào)道的結(jié)果中，標(biāo)記的細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)存活幾年的時(shí)間還可以持續(xù)發(fā)光，說(shuō)明 Luciferase 基因的標(biāo)記非常穩(wěn)定。

7. 可以用腫瘤塊而不是細(xì)胞接種嗎?

可以先用標(biāo)記的細(xì)胞在皮下接種，然后從皮下取出腫瘤塊進(jìn)行原位接種。

8. 標(biāo)記細(xì)胞與標(biāo)記基因所用的啟動(dòng)子有何不同?

標(biāo)記細(xì)胞一般用在細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá)的啟動(dòng)子, 顯示細(xì)胞的數(shù)目。標(biāo)記基因一般用此基因的啟動(dòng)子，與此基因平行表達(dá), 顯示此基因的表達(dá)數(shù)目，廈門逸漠使用的啟動(dòng)子是CMV。

9. 熒光素酶的表達(dá)高低與所用啟動(dòng)子的活性有關(guān)嗎?

有關(guān)，啟動(dòng)子的活性高，則熒光素酶的表達(dá)高，啟動(dòng)子的活性低，則熒光素酶的表達(dá)低。

10. 有幾種常用的熒光素酶?特性如何?

常用的熒光素酶有兩種，分別是Luciferase 和 Renilla 熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是 D-luciferin，后者的底物是 coelentarizine 。二者的發(fā)光顏色不一樣，前者所發(fā)的光波長(zhǎng)在 540-600nm，后者所發(fā)的光波長(zhǎng)在 460-540nm 左右。前者所發(fā)的光更容易透過(guò)組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快。大部分的發(fā)表文章通常使用前者用作報(bào)告基因， 也有一些文章使用兩者進(jìn)行雙標(biāo)記。

11. 組織切片可以觀察到生物發(fā)光嗎?

可以，但熒光酶的體外活性保持時(shí)間比較短， 約幾十分鐘。有相關(guān)的文獻(xiàn)。

12.正常成體小鼠可以看到體內(nèi)發(fā)光嗎?是否不需要裸鼠?

可以。成體老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的區(qū)別只在與對(duì)可見(jiàn)光的穿透性不同,可以看到成體正常老鼠的體內(nèi)發(fā)光。這正是這項(xiàng)技術(shù)的價(jià)值所在?？梢?jiàn)光的穿透能力在3-4cm, 所以大鼠也可以作為活體成像的動(dòng)物，并有很多關(guān)于大 鼠的文章。

13.熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度是否同細(xì)胞的數(shù)量成正比?

是的，熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度同標(biāo)記的靶點(diǎn)，包括細(xì)胞、基因、細(xì)菌和病毒的數(shù)量成正比。密西根大學(xué)Brian Ross發(fā)表的一篇文章專門研究了這個(gè)問(wèn)題。確定熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)成正比關(guān)系，并且線性關(guān)系到0.9 以上。

14.熒光素酶發(fā)光的波長(zhǎng)與體內(nèi)的穿透性如何關(guān)系?

熒光素酶發(fā)出的光主要是偏紅光,與綠色熒光蛋白(GFP)的綠色熒光不同。熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內(nèi)的穿透性要強(qiáng)近一百倍 。因?yàn)楣庠诓溉閯?dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白(hemoglobin)是造成體內(nèi)可見(jiàn)光被吸收的主要因素,其吸收可見(jiàn)光中藍(lán)綠光波段的大部分。但是在可見(jiàn)光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域，大量的光可以穿過(guò)組織和皮膚而被檢測(cè)到。

15.為什么建議盡量用RFP而不是GFP來(lái)檢測(cè)體內(nèi)發(fā)光?

紅光比綠光在體內(nèi)的穿透性要強(qiáng)近一百倍。波長(zhǎng)越長(zhǎng)的熒光越容易透過(guò)組織，

在條件允許的情況下，我們建議選擇波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光染料。

影響成像效果三個(gè)因素

主要需要考慮以下影響因素：底物給藥方式、熒光標(biāo)記物波長(zhǎng)和動(dòng)物毛發(fā)。

1.底物給藥方式

常用的底物給藥方式有腹腔注射和尾靜脈注射。

腹腔注射：迅速分布全身，并穿過(guò)包括大腦在內(nèi)的血液組織屏障;注射底物 10～20 分鐘后，發(fā)光信號(hào)達(dá)到峰值;60 分鐘內(nèi)逐漸減少，直到不可檢測(cè)。

尾靜脈注射：可提供更好的再現(xiàn)性和 5～10 倍的高信號(hào)，但是注射難度較高，代謝快。

建議：第一次使用熒光素酶底物成像，或者更換新品牌底物，需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察底物在何時(shí)達(dá)到峰值。確定注射熒光素底物和成像之間的最佳延遲，然后將此時(shí)間用于所有實(shí)驗(yàn)，以標(biāo)準(zhǔn)化成像數(shù)據(jù)。

2.熒光標(biāo)記物波長(zhǎng)

大多數(shù)生物體內(nèi)都表現(xiàn)出一種天然的熒光，通常被稱為「自發(fā)熒光」。這些熒光與標(biāo)記物發(fā)射波長(zhǎng)重疊，經(jīng)激發(fā)光照射會(huì)發(fā)射出與標(biāo)記物相似的熒光波長(zhǎng)，導(dǎo)致低信噪比，檢測(cè)靈敏度受限，甚至無(wú)法檢測(cè)。譬如，GFP 的最大激發(fā)波長(zhǎng)是 488 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)是 507 nm。

這和皮膚及毛發(fā)中的膠原蛋白和彈性蛋白等成分的發(fā)射波長(zhǎng)相近，有較高的背景信號(hào)。此外，標(biāo)記物激發(fā)波長(zhǎng)越短，散射越強(qiáng)，吸收越大，穿透深度越淺，越不利于體內(nèi)深層部位的信號(hào)檢測(cè)。

建議：使用近紅外波長(zhǎng)的熒光染料，優(yōu)點(diǎn)是更高信噪比，穿透更深，或使用 iRFP 作為報(bào)告基因，該熒光蛋白具有更高的亮度、光穩(wěn)定性和信噪比。

3.動(dòng)物毛發(fā)

C57BL/6 小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)周期由三個(gè)階段組成：靜止期(皮膚為淡粉色)、生長(zhǎng)期(皮膚變?yōu)樯罨疑蚝谏?、成熟期(毛發(fā)停止生長(zhǎng)，皮膚恢復(fù)為淡粉色)。

生長(zhǎng)期中的皮膚色素沉著是活體成像中的一個(gè)重要變量，特別是當(dāng)需要對(duì)小信號(hào)變化或動(dòng)物之間的差異敏感時(shí)。強(qiáng)烈著色的皮膚可導(dǎo)致 90% 以上的光信號(hào)衰減，這顯然會(huì)導(dǎo)致顯著的實(shí)驗(yàn)誤差。此外，就算是處于靜止期或成熟期的小鼠，身上的毛發(fā)也會(huì)造成一個(gè)數(shù)量級(jí)的光信號(hào)衰減。

建議：成像前一天，需要通過(guò)剃毛或化學(xué)脫毛來(lái)去除觀察區(qū)域的毛發(fā)，以便最大限度地收集信號(hào)。