胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是最致命的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升。據(jù)研究，90%的PDAC患者中存在原癌基因KRAS突變，且淋巴結(jié)（LN）轉(zhuǎn)移是PDAC中重要的轉(zhuǎn)移途徑?；诎邢騅RAS等位基因突變的基因治療可以消退70%的轉(zhuǎn)移性PDAC，表明KRAS在轉(zhuǎn)移性PDAC中具有治療潛力[1]。因此，研究PDAC中KRAS與LN轉(zhuǎn)移之間的作用機(jī)制具有重要意義。

環(huán)狀RNA（circRNA）是共價閉環(huán)的單鏈RNA，參與調(diào)節(jié)多種生物過程，如基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、蛋白質(zhì)翻譯以及與RBP特異性結(jié)合，已成為腫瘤發(fā)生中的一類重要分子。在膀胱癌的研究中曾有報道circRNA在KRAS突變誘發(fā)的癌癥中具有調(diào)節(jié)功能[2]，而關(guān)于circRNA與PDAC中KRAS突變誘導(dǎo)的LN轉(zhuǎn)移之間的作用機(jī)制卻知之甚少。

2023年6月26日，廣東省人民醫(yī)院陳汝福教授團(tuán)隊在Cancer Research（IF=11.2)發(fā)表文章Mutant KRAS mediates circARFGEF2 biogenesis to promote lymphatic metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma。作者鑒定了一種新的環(huán)狀RNA——circARFGEF2，發(fā)現(xiàn)其在KRAS等位基因G12D突變的PDAC中表達(dá)上調(diào)，并與KRAS G12D誘導(dǎo)的PDAC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這一點(diǎn)。研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，選擇性剪接因子QKI-5能激活circARFGEF2的生物發(fā)生，且介導(dǎo)circARFGEF2的miR-1205海綿作用并促進(jìn)JAK2的激活，進(jìn)而使STAT3發(fā)生磷酸化，最終激活JAK-STAT信號通路，使KRAS G12D誘導(dǎo)的PDAC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。綜上，本研究闡明了KRAS G12D突變相關(guān)的circRNA生物發(fā)生機(jī)制，并證實(shí)了circARFGEF2在KRAS G12D誘導(dǎo)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性PDAC中具有關(guān)鍵作用，揭示circARFGEF2可作為KRAS G12D誘導(dǎo)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性PDAC的潛在治療靶點(diǎn)。

circARFGEF2的鑒定和生物發(fā)生機(jī)制

首先，作者通過對PDAC組織和鄰近的正常組織（NAT）進(jìn)行了NGS測序，發(fā)現(xiàn)在PDAC組織中有50個circRNA表達(dá)上調(diào)，其中circARFGF2在KRAS G12D 誘導(dǎo)的PDAC中表達(dá)上調(diào)最顯著。而且，與原發(fā)性腫瘤相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性PDAC中的circARFGF2具有更高的表達(dá)水平，且呈正相關(guān)。作者進(jìn)一步通過RNase R測試等實(shí)驗(yàn)證明了circARFGEF2的環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有高度穩(wěn)定性。通過雙色熒光報告法和WB檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)QKI-5會促進(jìn)PDAC細(xì)胞中circARFGEF2的表達(dá)，而敲低QKI-5則減少了circARPGEF2的表達(dá)量，表明QKI-5參與了circARFGEF2的生物發(fā)生。通過Co-IP和pull-down實(shí)驗(yàn)表明，QKI-5募集U2AF35并結(jié)合內(nèi)含子3 1128-1180 nt和內(nèi)含子6 7672-7740 nt，以調(diào)節(jié)其前體mRNA剪接而成環(huán)。

circARFGF2在體內(nèi)外促進(jìn)KRAS G12D PDAC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

作者通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KRAS G12D PDAC細(xì)胞中的circARFGEF2下調(diào)抑制了淋巴管的形成、增殖和遷移能力，而過表達(dá)circARFGEF2則產(chǎn)生與之相反的結(jié)果。而且，過表達(dá)QKI-5增強(qiáng)了淋巴管的形成和遷移能力，但是同時敲低circARFGEF2的表達(dá)水平會抑制QKI-5誘導(dǎo)的淋巴管生成。接著，作者運(yùn)用IVIS和IHC技術(shù)和PET-CT掃描檢測胰腺中原位腫瘤的葡萄糖代謝水平發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)QKI-5顯著促進(jìn)癌細(xì)胞向胰周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并增加了原位異種移植PDAC小鼠模型中轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)數(shù)量，但同時敲低circARFGEF2則逆轉(zhuǎn)了該現(xiàn)象。綜上表明，QKI-5介導(dǎo)的circARFGEF2環(huán)化在體內(nèi)外促進(jìn)了KRAS G12D PDAC的淋巴管生成和轉(zhuǎn)移。

circARFGF2在KRAS G12D PDAC中作為miR-1205的海綿

作者運(yùn)用FISH、核質(zhì)分離和qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，circARFGEF2主要定位于KRAS G12D PDAC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。接著，作者預(yù)測到有4個miRNA與circARFGEF2靶向結(jié)合，通過RNA pull-down和FISH共定位驗(yàn)證了miR-1205與之結(jié)合作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)circARFGEF2誘發(fā)了HLEC管的形成和遷移，而過表達(dá)miR-1205明顯逆轉(zhuǎn)了這種結(jié)果。綜上表明，circARFGEF2在KRAS G12D PDAC細(xì)胞中充當(dāng)miR-1205海綿。

circARFGEF2激活KRAS G12D PDAC中的JAK2-STAT3途徑

作者通過轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定出JAK-STAT途徑是與circARFGEF2相關(guān)的最顯著富集的途徑。此外，在KRAS G12D PDAC細(xì)胞中，JAK2與circARFGEF2的表達(dá)水平呈正相關(guān)，而miR-1205與JAK2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。WB結(jié)果顯示，過表達(dá)circARFGEF2使JAK2表達(dá)水平上調(diào)，且增強(qiáng)STAT3磷酸化水平，敲低circARFGEF2則出現(xiàn)相反結(jié)果。此外，IHC分析和PET-CT掃描結(jié)果顯示，使用JAK2-STAT3途徑抑制劑WP1066能顯著逆轉(zhuǎn)circARFGEF2過表達(dá)對淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。綜上表明，circARFGEF2通過激活JAK2-STAT3途徑促進(jìn)KRAS G12D PDAC中的淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

QKI-5/circARFGEF2/JAK2途徑在KRAS G12D PDAC患者中的臨床意義

作者在PDAC患者中評估了QKI-5介導(dǎo)的circARFGEF2/miR-1205/JAK2途徑的臨床意義，結(jié)果表明miR-1205與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，而circARFGEF2、QKI-5和JAK2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性KRAS G12D PDAC中顯著上調(diào)。IHC分析顯示，QKI-5和JAK2與KRAS G12D PDAC中的circARFGEF2表達(dá)水平呈正相關(guān)。相關(guān)性分析顯示，JAK2與miR-1205表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，而與QKI-5表達(dá)水平呈正相關(guān)，并且circARFGEF2和miR-1205的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，表明QKI-5介導(dǎo)的circARFGEF2/miR-1205/JAK2軸在KRAS G12D PDAC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。從而可知，源自QKI-5依賴性剪接的circARFGEF2海綿吸附miR-1205并激活JAK2-STAT3信號通路，誘導(dǎo)KRAS G12D PDAC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)：

[1] Huang L, Guo Z, Wang F, et al., KRAS mutation: from undruggable to druggable in cancer. 2.Signal Transduct Target Ther 2021;6:386.

[2] Chen J, Sun Y, Ou Z, et al., Androgen receptor-regulated circFNTA activates KRAS signaling to promote bladder cancer invasion. EMBO Rep 2020;21:e48467.

原文鏈接：

https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-22-3997