線粒體脫氧核糖核酸缺失綜合征(MDS)是一種嚴(yán)重的、表型異質(zhì)的隱性遺傳病，表現(xiàn)為組織和器官中mtDNA（線粒體DNA)含量顯著降低。脫氧核糖核苷激酶(DGUOK)基因突變是肝腦型MDS的主要病因。絕大多數(shù)DGUOK突變型MDS患者因?yàn)閲?yán)重的肝功能衰竭,會(huì)在2歲前死亡。然而，鐵超負(fù)荷和肝損傷的病理機(jī)制仍然未被研究透徹，同時(shí)尋找肝腦型MDS的有效治療靶點(diǎn)已刻不容緩。

鑒于此，中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究所的劉興國(guó)研究員團(tuán)隊(duì)基于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和基因編輯技術(shù)，設(shè)計(jì)了一種衍生肝細(xì)胞類器官模型來(lái)考察肝腦型MDS的病理機(jī)制。

研究者將兩名患者的皮膚成纖維細(xì)胞重新編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)，通過(guò)CRISPR/Cas9校正了基因突變。為了糾正突變的DGUOK基因，設(shè)計(jì)的gRNA分別靶向P1（病人1，女）的外顯子6和P2（病人2，男）的內(nèi)含子1。然后將cas9質(zhì)粒和單鏈寡脫氧核苷酸(ssODNs)轉(zhuǎn)染到P1和P2?iPSCs中。挑選單克隆，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證，獲得了兩名患者的DGUOK突變校正克隆?；蚓庉嫼笮Ｕ膇PSCs的染色體組型(karyotype)正常。接著將患者來(lái)源iPSCs和校正后iPSCs誘導(dǎo)再分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞(iHep)，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建肝細(xì)胞類器官(iHep-Orgs)模型。

圖1| 患者來(lái)源以及基因矯正后的iPSCs誘導(dǎo)的肝細(xì)胞和類器官模型

研究者對(duì)iHep-Orgs的功能進(jìn)行了表征。肝細(xì)胞生物標(biāo)志物染色及肝功能測(cè)定的結(jié)果表明，三維培養(yǎng)的iHep-Orgs與二維培養(yǎng)的iHep相比，具有更為成熟的肝樣特征。

圖2|?iHep-Orgs的功能表征

然后，研究者評(píng)估了患者iHep的線粒體DNA耗竭和呼吸功能障礙的情況。研究發(fā)現(xiàn)，患者iHep中mtDNA拷貝數(shù)和表達(dá)水平下降，但線粒體數(shù)量并未下降。此外，iHep患者的基礎(chǔ)氧消耗量和ATP產(chǎn)生減少，呼吸鏈復(fù)合物活性降低。這些結(jié)果表明，患者iHep的線粒體呼吸活動(dòng)受損。

圖3|?患者iHep的線粒體DNA耗竭和呼吸功能障礙

隨后，研究者為了探討DGUOK突變型MDS鐵超載和致死性肝衰竭的病理機(jī)制，采用檸檬酸鐵銨(FAC)來(lái)誘導(dǎo)鐵超載。結(jié)果患者iHep-Orgs和iHep對(duì)鐵超載誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更敏感。而鐵死亡抑制劑DFO（去鐵胺）和Fer-1能夠逆轉(zhuǎn)這種細(xì)胞死亡，說(shuō)明肝衰竭是由鐵超載所引發(fā)的肝細(xì)胞鐵死亡所導(dǎo)致的。

圖4|?iHep-Orgs和iHep對(duì)鐵超載誘導(dǎo)的敏感性

其后作者設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定了細(xì)胞內(nèi)超載的游離鐵來(lái)源于轉(zhuǎn)鐵蛋白在溶酶體中的降解，并且自噬標(biāo)志物NCOA4?（核受體共激活因子4）在這一過(guò)程中扮演了關(guān)鍵角色。

圖5| mtDNA缺失綜合征的鐵死亡機(jī)制

總之，作者探究了DGUOK基因突變患者鐵死亡的病理機(jī)制，揭示了線粒體DNA缺失與鐵死亡之間的聯(lián)系。本研究結(jié)果為發(fā)現(xiàn)MDS患者肝功能衰新的治療途徑奠定了有力基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：Jingyi Guo, Lifan Duan, Xueying He, Shengbiao Li, Yi Wu, Ge Xiang, Feixiang Bao,Liang Yang, Hongyan Shi, Mi Gao, Lingjun Zheng, Huili Hu, and Xingguo Liu.A Combined Model of Human iPSC-Derived LiverOrganoids and Hepatocytes Reveals Ferroptosis in DGUOKMutant mtDNA Depletion Syndrome.Adv. Sci.?2021,?8, 2004680.

DOI: 10.1002/advs.202004680

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