ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。

在檢測(cè)時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗原）與固相載體表面的抗體反應(yīng)。洗滌后加入酶標(biāo)記的抗體，通過(guò)反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

一、ELISA樣本的處理

ELISA的檢測(cè)目的是為了實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須堅(jiān)持全面的質(zhì)量控制和全過(guò)程質(zhì)量檢測(cè)，在收集標(biāo)本前都必須有一個(gè)完整的計(jì)劃

注意事項(xiàng)

1、每個(gè)樣本量收集體積=100ulx檢測(cè)種類，如果要做復(fù)孔，標(biāo)本量收集體積=100ulx檢測(cè)種類x2

2、樣本收集后若在一周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)可保存于2-8°C，若不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)進(jìn)行分裝，凍存于-20°或-80°C，避免反復(fù)凍融

3、試劑盒的檢測(cè)范圍不等同于樣本中待測(cè)物的濃度范圍，建議實(shí)驗(yàn)前通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)估樣本中待測(cè)物的濃度并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣本。

4、血清標(biāo)本采集是應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解是會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色

5、為了保證尿液檢測(cè)的準(zhǔn)確性，必須正確收集尿液標(biāo)本和保存，收集尿液的容器必須要清潔干燥，最好使用一次性的容器，避免因用藥并清潔不到而造成的污染，尿液樣本必須新鮮，留取后，應(yīng)及時(shí)檢測(cè)或保存

6、標(biāo)本宜在新鮮是檢測(cè)如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。如在冰箱中保存過(guò)久，其中可能發(fā)生聚合，間接法ELISA中樂視本底加深，

7、反復(fù)凍融會(huì)使蛋白效價(jià)降低，所以待測(cè)樣本如需多次檢測(cè)，宜少量分裝凍存

二、標(biāo)本類型

01、ELISA的常見標(biāo)本

液體類標(biāo)本：血清、血漿、尿液、細(xì)胞上清、腦脊液等

培養(yǎng)細(xì)胞

組織標(biāo)本

02、ELISA標(biāo)本的保存

一般來(lái)說(shuō)，再5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4°C，標(biāo)本再冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致血清IgG聚合，是間接法的試劑本底加深，超過(guò)一周測(cè)定的需-20°C保存，凍結(jié)血清溶解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡，

渾濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。

測(cè)抗體的血清的標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，以少量分裝冰存，

保存血清只采集是就應(yīng)注意無(wú)菌操作，也可加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，抗凝不完全的?biāo)本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽(yáng)性，建議勁量不使用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。

03、ELISA標(biāo)本的處理

1、血清：室溫血液私人凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如有沉淀形成，應(yīng)再次離心

3.尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成分時(shí)，用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）仔細(xì)收集上清，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成分時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右，通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成分。

5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量，加入一定量的PBS，PH7.4，用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?，?biāo)本融化后任然保持2-8°C的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用，

6.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行試驗(yàn)，若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20°C保存，單應(yīng)避免反復(fù)凍融。

三、ELISA的檢測(cè)方法

ELISA的檢測(cè)方法有直接發(fā)、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法基雙抗夾心法，其中直接法和競(jìng)爭(zhēng)法應(yīng)用較少，應(yīng)有最多的是雙抗夾心法，其在敏感性基因【特異性上有明顯的優(yōu)勢(shì)】

直接法

將抗原固定于ELISA班上，然后用酶標(biāo)抗體直檢測(cè)抗原。

相較于其他類型的ELISA實(shí)驗(yàn)，直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少，檢測(cè)速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果不容易出錯(cuò)，

但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會(huì)與ELISA版結(jié)合，實(shí)驗(yàn)背景會(huì)比較高，而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗，實(shí)驗(yàn)不太靈活。另外由于沒有使用二抗，信號(hào)沒有被放大，降低了測(cè)定的靈敏度。

間接法

將抗原固定于ELISA班上，隨后分兩步進(jìn)行檢測(cè)：首先加入檢測(cè)抗體于抗原特異性結(jié)合，隨后加入酶標(biāo)二抗檢測(cè)并利用底物顯色。

于直接ELISA相比，間接ELISA用到酶標(biāo)二抗，具有更高的靈敏度，也需要更少的標(biāo)記抗體，更經(jīng)濟(jì)，間接ELISA還提供了更大的靈活性，

缺點(diǎn)：存在交叉反應(yīng)的可能性（酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合），可能會(huì)增加背景，同時(shí)與直接ELISA相比，間接ELISA實(shí)驗(yàn)多了二抗孵育的步驟，實(shí)驗(yàn)周期延長(zhǎng)。

夾心法

被檢測(cè)的抗原包被再兩個(gè)抗體之間其中一個(gè)抗體將抗原固定于載體上，即捕捉抗體，另一個(gè)則是檢測(cè)抗體，此抗體可用酶標(biāo)記后直接測(cè)定抗原的量，或不標(biāo)記，再透過(guò)酶標(biāo)記的二級(jí)抗體來(lái)測(cè)定抗原的量，這兩種抗體必須小心選取，才可以避免交互反應(yīng)貨競(jìng)爭(zhēng)相同額抗原結(jié)合部位。

競(jìng)爭(zhēng)法

預(yù)先將抗原包被再固相載體上，并加入酶標(biāo)記的特異性抗體，實(shí)驗(yàn)是，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢物是抗原，則待檢抗原于預(yù)先包被再固相載體上的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)抗體，如果待檢測(cè)物是抗體，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被再固相載體上的抗原，通過(guò)洗滌洗掉被競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的酶標(biāo)抗體，最后加底物顯色，需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原（或抗體）的量成反比

競(jìng)爭(zhēng)ELISA相對(duì)以上的三種方法更復(fù)雜一些，但以上三種ELISA類型都適用于競(jìng)爭(zhēng)ELISA的形式，其主要有點(diǎn)在于可檢測(cè)不純的樣品，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高，但存在整體敏感性和專一性較差的問題。

四、雙抗夾心法的操作步驟

ELISA實(shí)驗(yàn)的原理

1.包被：抗原或者抗體能以物理性吸附于固相載體表面，原因是蛋白質(zhì)和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原反應(yīng)等免疫活性：

2、標(biāo)記：抗原或者抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接成酶結(jié)合物而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特點(diǎn)：

3、顯色：酶結(jié)合物與相應(yīng)包被在固相載體的抗原或抗體結(jié)合后，也被固定在固相載體上，加入酶的底物之后可出現(xiàn)顯色反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的顏色深淺可計(jì)算抗原或者抗體的相對(duì)含量。

如何 選擇ELISA試劑盒？

1.特異性：ELISA試劑盒的特異性于試劑盒的關(guān)鍵組分，抗體對(duì)有關(guān)，若抗體對(duì)中之一為多抗，另一個(gè)必須為單抗，建議使用雙單抗，

2、靈敏度：靈敏度反映的是試劑盒檢出被檢物質(zhì)的最低量的能力，用戶可根據(jù)自己樣本中待檢指標(biāo)的量選擇合適的試劑盒，如果待檢指標(biāo)量很低，一般的試劑盒不能滿足要求，可選擇高敏的ELISA試劑盒。

3、重復(fù)性：科學(xué)實(shí)驗(yàn)講求重復(fù)性，一般ELISA試劑盒，期板內(nèi)和板間變異系數(shù)應(yīng)該控制在15%以內(nèi)。

4、簡(jiǎn)便性：試劑盒在保證高質(zhì)量數(shù)據(jù)的情況下，實(shí)驗(yàn)時(shí)間越短，操作越便利，越容易受到用戶歡迎，

五、ELISA的常見問題及解決方法