α-突觸核蛋白病

α-突觸核蛋白病是一類神經(jīng)退行性疾病的統(tǒng)稱，包括帕金森病（PD）、路易體癡呆（DLB）、多系統(tǒng)萎縮（MSA）、阿爾茨海默病路易體變體（LBV-AD）和純粹自主神經(jīng)衰竭(PAF)等疾病,是一類神經(jīng)退行性疾??；其特征是病理性α-突觸核蛋白（α-synuclein, α-Syn）在受損的神經(jīng)元中錯(cuò)誤折疊和異常聚集，逐漸在神經(jīng)元中形成不溶性α-Syn包涵體。

2023年6月28日，廣東省人民醫(yī)院王麗娟作為通訊作者在Advanced Science （IF=17.521）發(fā)表了題為“Cerebral Microvascular Injury Induced by Lag3-Dependent α-Synuclein Fibril Endocytosis Exacerbates Cognitive Impairment in a Mouse Model of α-Synucleinopathies ”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)靶向Lag3可有效阻斷α-突觸核蛋白向腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMVECs）傳遞，以提高認(rèn)知能力。值得注意的是，

在本研究中，作者使用了漢恒提供的慢病毒成功實(shí)現(xiàn)了Lag3 的敲低和過(guò)表達(dá)。

作者建立了兩種穩(wěn)定的α-突觸核蛋白病認(rèn)知障礙模型，分別在小鼠單側(cè)黑質(zhì)致密部、海馬和大腦皮層聯(lián)合注射α-Syn預(yù)合成纖維（α-Syn preformed fibrils, PFFs）和注射過(guò)表達(dá)人A53T α-Syn基因的腺相關(guān)病毒載體 (AAV-A53T)，在注射后6個(gè)月，作者檢測(cè)了這兩組模型及假手術(shù)組小鼠的酪氨酸羥化酶（TH）+和NeuN+神經(jīng)元的數(shù)量，且應(yīng)用Morris水迷宮（MWM）和新型物體識(shí)別（NOR）測(cè)試評(píng)估認(rèn)知障，發(fā)現(xiàn)模型小鼠表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)和記憶能力受損，并且這種認(rèn)知能力下降與腦微血管損傷相關(guān)。

圖1 注射AAV和PFFs的小鼠認(rèn)知功能損傷并伴有輕度神經(jīng)元損傷

接下來(lái)作者評(píng)估了毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)、腦微血管密度、分類血管（靜脈和動(dòng)脈）的體積/直徑以及微血管周細(xì)胞覆蓋率，以反映CMS的變化。對(duì)不同大腦區(qū)域（中腦、海馬體和大腦皮層）進(jìn)行了毛細(xì)血管成像，顯示PFFs組的血管灌注量明顯低于AA V-A53T組和假手術(shù)組；此外，PFFs組的靜脈/動(dòng)脈血管體積和直徑明顯小于假手術(shù)組和AAV-A53T組。以上結(jié)果說(shuō)明，與AAV誘導(dǎo)的病理學(xué)相比，α-Syn PFF誘導(dǎo)的病理學(xué)導(dǎo)致更嚴(yán)重的CMS損傷。為了研究CMS損傷是否伴有神經(jīng)膠質(zhì)炎癥，通過(guò)電離鈣結(jié)合適配器分子（IBA1）和神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）的共染色來(lái)測(cè)量神經(jīng)膠質(zhì)的活化。但令人驚訝的是，盡管PFFs組CMS損傷更嚴(yán)重，但PFFs組IBA1/GFAP陽(yáng)性細(xì)胞比率的增加遠(yuǎn)小于AAV-A53T組，這表明α-Syn PFFs比AAV-A53T導(dǎo)致更輕微的神經(jīng)膠質(zhì)炎癥。

圖2與注射AAV小鼠中相比，注射PFF導(dǎo)致更嚴(yán)重的CMS損傷和更少的膠質(zhì)炎癥

在神經(jīng)系統(tǒng)中，微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMVECs）是NVU的中心成分，調(diào)節(jié)血腦屏障以維持大腦的功能穩(wěn)態(tài)。有證據(jù)表明血腦屏障破裂是人類認(rèn)知功能障礙的早期生物標(biāo)志物，因此，作者接下來(lái)研究了模型中血腦屏障是否受損。為了評(píng)估血腦屏障，分析了緊密連接蛋白的表達(dá)，然后通過(guò)靜脈尾靜脈注射伊文思藍(lán)（EB）和兩種尺寸的熒光標(biāo)記右旋糖酐來(lái)測(cè)試體內(nèi)血腦屏障的通透性。在PFFs組中，所有緊密連接蛋白的表達(dá)都明顯降低，而在AAV-A53T組中，只有Occludin在中腦、海馬和大腦皮層的表達(dá)以及Zo-1在中腦的表達(dá)降低。此外，PFFs組中所有緊密連接蛋白的相對(duì)表達(dá)均低于AAV-A53T組。通過(guò)qPCR測(cè)量的緊密連接蛋白的mRNA表達(dá)顯示出與蛋白表達(dá)相同的趨勢(shì)。這些結(jié)果表明α-Syn PFFs可導(dǎo)致更嚴(yán)重的緊密連接蛋白表達(dá)下降。

圖3與注射AAV小鼠中相比，注射PFFs導(dǎo)致緊密連接蛋白表達(dá)的更顯著降低和血腦屏障通透性的更顯著增加

作者用Alexa Fluor 488標(biāo)記 PFFs發(fā)現(xiàn)外源性PFFs在48小時(shí)后通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入BMVECs形成不溶性α-Syn 包涵體。由于Lag3是 PFFs經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入小鼠神經(jīng)元中的所必需的，故作者推測(cè)BMVECs中的Lag3也參與了PFFs進(jìn)入BMVECs。在源自野生型（WT）小鼠的BMVECs中觀察到外源性 PFFs和Lag3的共定位，但在源自Lag3?/?小鼠的BMVECs中幾乎沒(méi)有觀察到，這證實(shí)了作者這一猜想。接下來(lái)，作者調(diào)節(jié)了Lag3的表達(dá)，以評(píng)估它是否會(huì)影響 PFFs的內(nèi)吞作用。使用從WT或Lag3?/?小鼠中提取的原代BMVECs，用LV-Lag3、LV-Lag-shRNA或者陰性對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)Lag3的過(guò)表達(dá)增加了PFFs的內(nèi)吞作用及不溶性α-Syn包涵體的產(chǎn)生，而Lag3的敲除顯著降低 PFFs的內(nèi)吞作用及不溶性α-Syn包涵體的產(chǎn)生。

圖4 PFFs通過(guò)Lag3依賴性內(nèi)吞作用進(jìn)入BMVECs形成α-Syn不溶性包涵體

接下來(lái)，作者研究了內(nèi)皮細(xì)胞特異性Lag3基因敲除是否在體內(nèi)阻止PFFs進(jìn)入BMVECs，然后改變PFFs對(duì)認(rèn)知和CMS的影響。實(shí)驗(yàn)分為四組：注射PBS的對(duì)照小鼠（PBS-Lag3-WT小鼠）、注射PBS內(nèi)皮細(xì)胞特異性Lag3條件性敲除小鼠（PBS-Rag3-ECs-Cko小鼠）、注射PFFs的對(duì)照小鼠（PFFs-Lag3-WT小鼠）和注射PFFs的內(nèi)皮細(xì)胞特異性Lag3條件性敲除小鼠（PFFs-Lag3-ECs-Cko小鼠），在注射后6個(gè)月的檢測(cè)認(rèn)知功能。PBS-Lag3-WT小鼠、PFFs-Lag3-WT小鼠表現(xiàn)出顯著的認(rèn)知能力下降和情緒障礙，盡管PFFs-Lag3-ECs-Cko小鼠的結(jié)果仍然不如PBS-Lag3-ECs-Cko小鼠，但它們的結(jié)果優(yōu)于PFFs-Lag3-WT小鼠。這些結(jié)果所示，小鼠中內(nèi)皮細(xì)胞特異性Lag3的缺失可以逆轉(zhuǎn)PFFs誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙。

圖5 小鼠內(nèi)皮細(xì)胞特異性Lag3的缺失可以逆轉(zhuǎn)PFFs誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙

綜上所述，這一研究為證實(shí)α-突觸核蛋白病認(rèn)知障礙具有共性微血管病理機(jī)制提供了關(guān)鍵證據(jù)，并且揭示了靶向Lag3阻斷α-Syn纖維向腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)散對(duì)改善認(rèn)知功能的重要意義。