大麗輪枝菌是一種土壤傳播的植物真菌病原體，可穿透植物根系，并在木質(zhì)部定植，導(dǎo)致植物發(fā)生黃萎病，降低許多重要經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量。該病原體在世界范圍內(nèi)均有分布，以微菌核形式在土壤中可存活14年以上，且寄主范圍廣泛，危害性強(qiáng)。目前關(guān)于大麗輪枝菌的眾多效應(yīng)因子如何調(diào)節(jié)植物免疫仍有許多未知。

2023年1月，西北農(nóng)林科技大學(xué)胡小平團(tuán)隊(duì)在Microbiology Spectrum上發(fā)表了題為“Verticillium dahliae Effector VdCE11 Contributes to Virulence by Promoting Accumulation and Activity of the Aspartic Protease GhAP1 from Cotton”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌的一種新效應(yīng)因子VdCE11，它可以與棉花的天冬氨酸蛋白酶（GhAP1）靶向互作，并促進(jìn)GhAP1的積累，提高其水解酶活性，導(dǎo)致棉花黃萎病易感性增強(qiáng)。

文章思路與結(jié)果

1.尋找效應(yīng)蛋白

通過對(duì) XJ592進(jìn)行全基因組測(cè)序，鑒定到793個(gè)分泌蛋白。根據(jù)經(jīng)典的效應(yīng)因子結(jié)構(gòu)特征分析，選擇其中67個(gè)作為候選效應(yīng)因子，并瞬轉(zhuǎn)本氏煙，發(fā)現(xiàn)VdCE11會(huì)引起煙草葉片細(xì)胞死亡（圖1-A)。

2.看效應(yīng)蛋白對(duì)植物免疫反應(yīng)系統(tǒng)中的marker影響？

與轉(zhuǎn)GFP對(duì)照相比，轉(zhuǎn)的葉片病程防御相關(guān)基因表達(dá)量顯著升高、HO積累顯著升高，說明VdCE11在植物免疫應(yīng)答的調(diào)控中起著重要作用（圖1-C、D）。

圖1

3.還發(fā)現(xiàn)VdCE11通過引發(fā)植物免疫反應(yīng)，使轉(zhuǎn)VdCE11的煙草葉片抵抗其他真菌（灰葡萄孢菌、核盤菌）能力增強(qiáng)（圖2）。

圖2

4.構(gòu)建效應(yīng)蛋白敲除株，檢測(cè)真菌對(duì)植物宿主的毒力反應(yīng)變化？

為更深入地了解VdCE11的功能，構(gòu)建大麗輪枝菌ΔVdCE11敲除株，侵染棉花和擬南芥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種ΔVdCE11突變體后，棉花和擬南芥植株的病害癥狀都比接種野生型XJ592的植株要弱得多。通過回補(bǔ)GFP-tagged VdCE11，大麗輪枝菌毒力恢復(fù)，說明VdCE11促進(jìn)大麗輪枝菌對(duì)棉花和擬南芥的毒力效應(yīng)（圖3.A-F）。

而接種大麗輪枝菌ΔVdCE11敲除株的煙草，毒力作用反而減弱，可能與VdCE11會(huì)引發(fā)煙草免疫反應(yīng)有關(guān)。說明VdCE11對(duì)不同宿主植物的毒力作用不同（圖3.G-H）。

圖3

5.尋找效應(yīng)蛋白在植物宿主中的靶蛋白?

為了尋找VdCE11的宿主靶點(diǎn)，以VdCE11為誘餌，對(duì)感染真菌的棉花根系cDNA文庫(kù)進(jìn)行了酵母雙雜交（Y2H）篩選，結(jié)果篩選到互作蛋白GhAP1，并通過Y2H、CoIP等體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)互作進(jìn)行了證實(shí)（圖4）。

圖4

6.進(jìn)一步分析植物中靶蛋白功能？

對(duì)在棉花中篩選到的靶蛋白GhAP1進(jìn)行研究，首先檢測(cè)了棉花接菌后，不同時(shí)間GhAP1的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)接菌后24h，GhAP1轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。

構(gòu)建沉默植株，接種XJ592，與野生型棉花對(duì)比觀察形態(tài)指標(biāo)、真菌定植量、病程相關(guān)基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)沉默棉株，對(duì)大麗輪枝菌抗性增強(qiáng)，說明GhAP1是棉花對(duì)黃萎病抗性的負(fù)調(diào)控因子（圖5）。

圖5

7.檢測(cè)效應(yīng)蛋白對(duì)靶蛋白含量及活性的影響?

通過檢測(cè)共轉(zhuǎn)VdCE11和GhAP1煙草葉片中的GhAP1含量；以及通過體外酶解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)VdCE11可以促進(jìn)GhAP1的積累和酶活性（圖6）。

圖6

總結(jié)

VdCE11在宿主-病原體相互作用中的功能機(jī)制預(yù)測(cè)模型

本研究鑒定到了一種大麗輪枝菌效應(yīng)因子VdCE11，它可以誘導(dǎo)本氏煙草的細(xì)胞死亡和防御反應(yīng)。在棉花、擬南芥中，VdCE11促進(jìn)大麗輪枝菌對(duì)宿主的毒力作用。同時(shí)，通過酵母雙雜交篩選，找到了其在陸地棉中的靶蛋白GhAP1。發(fā)現(xiàn)VdCE11可促進(jìn)GhAP1蛋白的積累，提高其水解酶活性，揭示了大麗輪枝菌毒力效應(yīng)的作用新機(jī)制，為認(rèn)識(shí)黃萎病提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)模型。

DOI:?10.1128/spectrum.03547-22