前言

老齡化相關(guān)疾病的患病率高、預(yù)后較差。而探尋合適的衰老模型，預(yù)防衰老相關(guān)性疾病具有重要意義。文章通過研究小鼠甲狀腺毒癥與衰老的關(guān)系，采用LC-MS、GC-MS非靶代謝組學(xué)及DIA蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合的方法，分析內(nèi)源性代謝組和血清蛋白質(zhì)組的變化。為甲狀腺毒癥小鼠衰老模型的建立及探索抗衰老藥物研發(fā)提供新思路。

2022年06月，魯南制藥集團(tuán)股份有限公司馮芹和張貴民研究員課題組在Frontiers in Immunology期刊發(fā)表了題為 “The Aging Features of Thyrotoxicosis Mice: Malnutrition,Immunosenescence and Lipotoxicity ”的研究成果，通過LC-MS、GC-MS非靶代謝組學(xué)和DIA蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，描繪了血清蛋白質(zhì)組和內(nèi)源性代謝圖譜，發(fā)現(xiàn)了小鼠甲狀腺毒癥與衰老特征，探究了甲狀腺毒癥與衰老疾病的機(jī)理，為探究衰老機(jī)制及抗衰老藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

中文標(biāo)題：甲狀腺毒癥小鼠的衰老特征：營(yíng)養(yǎng)不良，免疫衰老與脂毒性

研究對(duì)象：小鼠

發(fā)表期刊：Frontiers in Immunology

影響因子：8.786

發(fā)表時(shí)間：2022年6月

合作單位：魯南制藥集團(tuán)股份有限公司

運(yùn)用生物技術(shù)：LC-MS非靶代謝組學(xué)、GC-MS非靶代謝組學(xué)、DIA蛋白質(zhì)組學(xué)（由歐易/鹿明生物提供技術(shù)支持）

研究思路

研究方法

1. 實(shí)驗(yàn)分組

（1）對(duì)照組：雌性KM小鼠

（2）模型組：雌性KM小鼠+口服甲狀腺素片混懸液

2. 技術(shù)路線

2.1血常規(guī)檢查：EDTAK2抗凝劑、自動(dòng)血液分析儀、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的陽(yáng)性率、PerCP-Cy?5.5小鼠外周血CD3、FITC 標(biāo)記大鼠抗小鼠CD4抗體、APC-H7大鼠抗小鼠CD8a、PE大鼠抗小鼠IFN-γ

2.2 CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)：IFN-γ+T淋巴細(xì)胞、CytoFLEX流式細(xì)胞儀

2.3血清生化分析：BS-800全自動(dòng)生化分析儀

2.4血清蛋白質(zhì)組測(cè)定：DIA-MS

2.5 血清LC-MS非靶代謝組學(xué)：ACQUITY UHPLC聯(lián)合AB SCIEX Triple TOF 5600?

2.6 血清GC-MS非靶代謝組學(xué): Agilent 7890B GC聯(lián)合Agilent 5977A MSD

2.7 糞便LC-MS非靶代謝組學(xué)：Dionex Ultimate 3000RS UHPL

3.統(tǒng)計(jì)分析：

ANOVA、a log-rank test、DIA、OPLS-DA 、S- t檢驗(yàn)、Pearson correlation、R軟件、Metascape、STRING、progenesis Q、CytExpert、Spectronaut Pulsa?

研究結(jié)果

1、不同血細(xì)胞計(jì)數(shù)和生化指標(biāo)的變化

血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示白細(xì)胞（WBC）、中性粒細(xì)胞（NEUT）、淋巴細(xì)胞總數(shù)（淋巴）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB），紅細(xì)胞壓積（HCT）和血小板（PLT）均下降，表明過量甲狀腺素會(huì)引起全血細(xì)胞減少（表1）。

小鼠連續(xù)攝入過量甲狀腺素20天后，轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）顯著升高，表明小鼠有肝損傷?？偟鞍祝═P）、白蛋白（ALB）和球蛋白（Glb）水平顯著降低，表明過量的甲狀腺素導(dǎo)致低蛋白血癥或低白蛋白血癥?？偰懝檀迹═C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDC-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平顯著降低，而甘油三酯（TG）水平顯著降低顯著升高，表明甲狀腺毒癥小鼠有低膽固醇血癥、低脂血癥和高脂血癥。

表1 | 甲狀腺毒癥小鼠不同血細(xì)胞計(jì)數(shù)和生化指標(biāo)的變化

2、淋巴細(xì)胞亞群和功能的變化

與正常對(duì)照組比，甲狀腺毒癥小鼠的CD3+CD4+百分比顯著下降，而CD3+CD8的百分比顯著增加，所以CD4+/CD8+的百分比下降明顯。CD3+CD4+IFN-γ+的百分比也顯著降低（圖2）。

圖2 | 淋巴細(xì)胞亞群和功能的變化

3、甲狀腺毒癥小鼠與正常小鼠血清蛋白質(zhì)組比較分析

PCA分析表明，甲狀腺毒癥小鼠與正常小鼠兩組之間有差異（圖3A）。DIA蛋白質(zhì)組學(xué)分析了甲狀腺毒癥小鼠中162種差異表達(dá)的蛋白（DEPs），其中6種上調(diào)，156種下調(diào)（圖3B）。Metascape在線分析法對(duì)156種下調(diào)蛋白進(jìn)行了分析（圖3C）。

圖3 | 比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析

STRING分析了補(bǔ)體、凝血級(jí)聯(lián)、Alb和Ttr（圖4A）。血液凝固通路和抗凝纖溶因子均被下調(diào)，而在這些下調(diào)蛋白中，32種與免疫系統(tǒng)相關(guān)，表明體液免疫應(yīng)答下降。大量免疫球蛋白下調(diào)，表明適應(yīng)性免疫系統(tǒng)也隨之下降（圖4B）。對(duì)Alb、Trf以及補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明Alb與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)中的DEPs呈正相關(guān)（圖4C-D）。

圖4 | 補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)中下調(diào)的DEPs

通過STRING在線分析，發(fā)現(xiàn)許多DEPs與體內(nèi)平衡有關(guān)，負(fù)責(zé)脂質(zhì)運(yùn)輸、離子運(yùn)輸和維生素運(yùn)輸。它們的下調(diào)表明脂質(zhì)、離子和化學(xué)物質(zhì)的體內(nèi)平衡被破壞，影響甲狀腺毒癥小鼠系統(tǒng)的多細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育（圖5A）。此外，下調(diào)的DEPs與多細(xì)胞生物的發(fā)育直接相關(guān)（圖5B）。

圖5 | 下調(diào)的DEPs與體內(nèi)平衡和多細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育有關(guān)

4、血清LC-MS代謝組學(xué)分析結(jié)果及其與蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)性

甲亢組和正常組之間的OPLS-DA評(píng)分存在顯著差異?；?strong>LC-MS代謝組學(xué)鑒定并量化了血清中821種代謝物，其中157種為差異表達(dá)代謝物（DEMs）。

KEGG途徑分析表明，DEMs富含類固醇激素生物合成、初級(jí)膽汁酸生物合成、膽汁分泌、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、花生四烯酸代謝、鞘脂信號(hào)通路等途徑。在Alb和C1qb顯著相關(guān)的條件下，LC-MS DEMs中篩選出20個(gè)DEMs，其中下調(diào)的DEMs與下調(diào)的DEPs呈正相關(guān)（圖6）。

圖6 | 血清LC-MS代謝組學(xué)分析及其與蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)性

5、血脂代謝組學(xué)分析結(jié)果及其與蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)性

基于Lipidmaps數(shù)據(jù)庫(kù)，LC- MS代謝組學(xué)鑒定并量化了血清中3333種脂質(zhì)代謝物，其中425種為差異表達(dá)代謝物（DEMs），包括240種上調(diào)和185種下調(diào)。血脂DEMs與DEPs進(jìn)行相關(guān)性分析，在與Alb和C1qb顯著相關(guān)的條件下，篩選出13個(gè)脂質(zhì)DEMs（圖7）。

圖7 | 血脂代謝組學(xué)分析及其與蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)性

6、血清GC-MS代謝組學(xué)分析結(jié)果及其與蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)性

甲亢組和正常組之間的OPLS-DA評(píng)分存在顯著差異。GC-MS代謝組學(xué)鑒定并定量檢測(cè)了885種血清中的代謝物，其中80種為差異表達(dá)代謝物（DEMs，13種上調(diào)，67種下調(diào)）。

KEGG途徑分析表明， DEMs在蛋白質(zhì)消化和吸收、氨酰tRNA生物合成、氨基酸生物合成、礦物質(zhì)吸收、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體等途徑中富集。Alb和C1qb同時(shí)顯著相關(guān)的條件下，篩選出10了個(gè)脂質(zhì)DEMs。其中，下調(diào)的DEMs與下調(diào)的DEPs呈正相關(guān)，上調(diào)的DEMs與下調(diào)的DEPs呈負(fù)相關(guān)。

圖8 | 血清GC-MS代謝組學(xué)分析

7、糞便LC-MS代謝組學(xué)分析結(jié)果

甲狀腺毒癥組和正常組之間的OPLS-DA評(píng)分有顯著差異。基于LC-MS代謝組學(xué)鑒定并定量了1820種代謝物，其中226種為差異表達(dá)代謝物（DEMs）。

KEGG途徑分析表明，DEMs富含花生四烯酸代謝、甾體激素生物合成、亞油酸代謝、神經(jīng)活性配體受體相互作用等途徑。DEMs的分類表明，氨基酸、肽及類似物大多數(shù)被上調(diào)。在甲狀腺毒癥小鼠的糞便中，雄甾烷甾體、膽甾烷甾體、膽汁酸、醇及其衍生物、孕烷甾體、二十碳烯酸、脂肪酸酯、羥基甾體、亞麻酸及其衍生物顯著下調(diào)。

大多數(shù)DEMs是二肽，它們可能無法通過KEGG分析，因此并未在圖中顯示。二肽應(yīng)在蛋白質(zhì)消化和吸收途徑中的上調(diào)，表明氨基酸和二肽會(huì)隨著糞便的排泄而丟失，這也是低蛋白血癥的原因（圖9）。

圖9 | 糞便LC-MS代謝組學(xué)分析

8、血清質(zhì)譜結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性

LC-MS和GC-MS同時(shí)檢測(cè)血清中的DEMs，其結(jié)果是一致的。LC-MS檢測(cè)到TGs上調(diào)，GC-MS檢測(cè)到膽固醇下調(diào)，LC-MS/MS檢測(cè)到Alb下調(diào)與生化試驗(yàn)結(jié)果一致（表2）。DEPs中的Apoa1、Apoa2和Apoa4代表HDL，它們的下調(diào)與生化試驗(yàn)中HDL-C的結(jié)果一致?？偣灿?5種免疫球蛋白或片段在DEPs、Jchain、Igkc和Ighg中被發(fā)現(xiàn)下調(diào)選擇其為代表，生化試驗(yàn)結(jié)果與Glb一致。所有的比較都證明了MS檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2?| 不同檢測(cè)方法下DEM和DEP的一致性

相關(guān)討論

研究發(fā)現(xiàn)血常規(guī)顯示過量的甲狀腺素導(dǎo)致了白細(xì)胞總數(shù)減少。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出的甲狀腺毒小鼠CD4/CD8比值和CD4+IFN-γ+T細(xì)胞數(shù)量減少，表明發(fā)生了免疫衰老。DIA蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示了免疫功能下降。脂毒性代謝產(chǎn)物的上調(diào)是免疫衰老的原因。

研究結(jié)論

文章通過LC-MS和GC-MS非靶代謝組學(xué)聯(lián)合DIA蛋白質(zhì)組學(xué)方法，檢測(cè)甲狀腺毒癥小鼠的血清蛋白和脂質(zhì)代謝物等，并從營(yíng)養(yǎng)、代謝、免疫、內(nèi)分泌角度分析甲狀腺毒癥與衰老疾病的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂、營(yíng)養(yǎng)不良、免疫衰老和脂毒性，是引發(fā)衰老相關(guān)疾病的機(jī)制。通過本研究不僅可用于衰老相關(guān)疾病的預(yù)防，也可用于新藥的研發(fā)。

小鹿推薦

文章通過LC-MS、GC-MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)與DIA蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，以甲狀腺毒癥模型為基礎(chǔ)探究衰老疾病的機(jī)制，并為抗衰老藥物的研發(fā)提供新思路。

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