組織脫水是病理制片很重要的一環(huán)，間接影響到后面的染色結(jié)果，因?yàn)楝F(xiàn)在多數(shù)是全封閉式脫水機(jī)脫水，所以脫水環(huán)節(jié)往往容易被忽視，今天咱們就聊一聊脫水那些事兒。

01

?原理?

組織在固定液長(zhǎng)時(shí)間浸泡后，會(huì)含大量的水分，為了制片和長(zhǎng)時(shí)間保存，必須將水分置換成石蠟。
水和石蠟是不相溶的，水也不溶于二甲苯，但水溶于乙醇，乙醇和石蠟都可以溶于二甲苯，所以利用乙醇和二甲苯作為媒介，最終將組織中的水分替換成石蠟。

02

流程?

明白了原理，那流程就簡(jiǎn)單了，自然是依次浸入乙醇、二甲苯、石蠟了。

但組織突然進(jìn)入高濃度乙醇會(huì)發(fā)生收縮和變形，不利后續(xù)包埋、切片、染色，所以乙醇要從低濃度到高濃度依次進(jìn)行，且不要在高濃度時(shí)間過久。研究表明乙醇脫水能力在60%-95%濃度之間是相對(duì)穩(wěn)定，低于60%的乙醇脫水能力下降明顯，初始乙醇濃度低于50%，會(huì)很快失去脫水效應(yīng)。

因水分被溶劑（如二甲苯）取代，二甲苯與玻璃的折光率非常接近，都是1.5左右，我們用光學(xué)顯微鏡觀察，感覺組織塊變得透亮，因此稱之為透明。

最后是浸蠟，溫度為剛剛超過石蠟熔點(diǎn)為宜，熔點(diǎn)58-60°的石蠟，蠟缸溫度設(shè)置62°為宜，太高可能會(huì)燙壞組織。

附上我整理的各大醫(yī)院病理科脫水條件，雖然脫水機(jī)不一樣，梯度乙醇濃度也有差異，但結(jié)果都很美麗，大多都是低濃度乙醇時(shí)間久，高濃度乙醇時(shí)間短；二甲苯1時(shí)間長(zhǎng)，二甲苯2時(shí)間短；石蠟1時(shí)間短，石蠟3時(shí)間長(zhǎng)。

03

關(guān)于脫水機(jī)

我司用的是徠卡ASP300S，整體體驗(yàn)不錯(cuò)，操作簡(jiǎn)單，脫水效果也不錯(cuò)，很穩(wěn)定，美中不足的是一個(gè)脫水缸，大小組織需要分成2次脫水。

但徠卡已經(jīng)有了2缸脫水機(jī)HistoCore?PEGASUS，大小組織分開脫水，節(jié)約時(shí)間和精力，還是很不錯(cuò)的，就是價(jià)格也很美麗。

04

關(guān)于試劑更換周期?

根據(jù)重慶人民醫(yī)院劉瑾老師研究，第一缸７５％ 的乙醇每次脫水后下降２°，１９ 次后第一缸乙醇只有５０°，他每次脫水59個(gè)組織，大約1121個(gè)組織后，更換第一缸75%乙醇，后面的下移替換。

從第１０ 次檢測(cè)開始，出現(xiàn)乙醇濃度下降，因此調(diào)整脫水時(shí)間，把第１缸７５％ 乙醇減少３０ｍｉｎ，把第２ 缸７５％ 增加３０ｍｉｎ，同時(shí)在第１ 缸１００％ 乙醇（脫水的倒數(shù) 第 二 缸）增 加 ２０ ｍｉｎ，通 過 這 種 時(shí)間的調(diào)整，組織脫水取得了很好的效果。

所以可以在脫水機(jī)設(shè)置一個(gè)常規(guī)程序，一個(gè)是脫600個(gè)組織后的程序，更改下在不同梯度乙醇中的時(shí)間。

當(dāng)然劉老師的結(jié)果也是他那個(gè)條件下的試驗(yàn)，具體還要就結(jié)合各自的設(shè)備、試劑等實(shí)際條件來設(shè)定程序。

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05

關(guān)于腦組織脫水?

根據(jù)資料得知.腦組織中含有大量的磷脂和水,其中磷脂是由含有甘油的腦磷脂和一些不含甘油的神經(jīng)磷脂組成的。腦磷脂的合成是由甘油三酯的重要中間產(chǎn)物磷脂酸水解為甘油二酯.其為腦磷脂的合成提供脂防酸和甘油部分絲胺酸脫鞍后生成乙醇胺。乙醇胺和膽堿參與腦磷脂合成前先活化成CDP-乙醇胺.然后合成腦磷脂。腦磷脂在其合成.分解的整個(gè)生化活動(dòng)中伴隨有大量的能量的轉(zhuǎn)變和交換(ATP/ADP)，在所有這些生化反應(yīng)過程中需要大量的水作為媒體環(huán)境.故腦組織總含水量大大高于其它組織。再者腦磷脂合成和分解都需要酶的作用.而這部分水分子在靜態(tài)時(shí)與腦磷脂的結(jié)合比較牢固。

針對(duì)腦組織這一特性，在低濃度酒精的時(shí)間要適當(dāng)延長(zhǎng)1-2小時(shí)，可以為腦組織單獨(dú)設(shè)置一個(gè)脫水程序。

但最重要的還是固定，腦組織最佳固定方式是灌注固定，不想灌注的要把腦子剪成3-4份再固定。

灌注固定可以參考徐一菲-北京中醫(yī)藥大學(xué)-《不同灌注方法及灌注量對(duì)大鼠腦組織及神經(jīng)元固定的影響》結(jié)果，注射器+剪右心耳在耗時(shí)耗液較少的情況下能夠較好固定腦組織。

具體操作：

剪肝組：提前準(zhǔn)備好裝有生理鹽水和 4%多聚甲醛的 50 ml 注射器，左手捏持心臟，右手持剪刀在心尖處剪一小口，將灌注針插入左心室并向上推送至升主動(dòng)脈，止血鉗固定，并打開腹腔結(jié)扎腹主動(dòng)脈。剪碎肝臟，先用生理鹽水灌注，當(dāng)肝臟顏色變白或變褐色，即可更換 4%多聚甲醛，待大鼠老鼠頭后仰， 前肢劇烈抽動(dòng)；前肢及頸部僵硬時(shí)，表明灌注固定完成。

實(shí)驗(yàn)組:其他方法同剪肝組，從心尖處插入灌注針后，結(jié)扎腹主動(dòng)脈，剪破右心耳，先用生理鹽水灌注，當(dāng)從右心耳流出澄清液體時(shí)，即可更換 4%多聚甲醛，待大鼠頭后仰，前肢劇烈抽動(dòng)；前肢及頸部僵硬時(shí)，表明灌注固定完成。

06

注意事項(xiàng)?

1. 取材一定不要太厚，最理想是2cmX2cmX3mm大小，固定不好，也會(huì)影響脫水及后續(xù)染色；

2. 乙醇和二甲苯不要同時(shí)更換，防止組織變脆；

3. 乙醇作為最常用的脫水劑，脫水能力較強(qiáng)，對(duì)組織有較明顯的收縮作用，為避免過度收縮導(dǎo)致后面乙醇無法浸到組織內(nèi)部，故起始濃度最好為７０％ 乙醇水溶液，隨后是９５％ 乙醇和無水乙醇。

4. 我們?cè)趯?shí)踐中發(fā)現(xiàn)組織在95％酒精中時(shí)間長(zhǎng) 有 利 于 組織脫水，但要控制組織在純酒精中的停留時(shí)間，以每道1～2小時(shí)為佳，組織不易收縮變硬。

5. 我們?cè)诠ぷ髦畜w會(huì)到，在固定、 脫水及透明過程中設(shè)定的溫度參數(shù)大于35℃極易引起組織變硬和收縮現(xiàn)象。因此所設(shè)的溫度參數(shù)一般為35℃以下。

6. 除脫水外固定后水洗也是影響切片質(zhì)量的一個(gè)重要因素，水洗不夠徹底?容易造成脫片和染色不鮮?對(duì)于需做免疫組化的組織?由于固定后殘余的福爾馬林不利于組織內(nèi)抗原的保存?因此充分水洗尤為重要。初始程序?yàn)闄C(jī)洗0.5h并且設(shè)置一定時(shí)間輪換使液體中積存大量福爾馬林從根本上說并未達(dá)到?jīng)_洗的目的；而新程序則改為流水沖洗0.5h?不僅保證每次清洗都是新鮮清水，而且流水的沖刷力能更好的去除福爾馬林溶液。

7. 二甲苯致癌，更換實(shí)驗(yàn)人員注意做好防護(hù)，在通風(fēng)櫥內(nèi)更換。

以上就是小諾關(guān)于組織脫水的一些經(jīng)驗(yàn)分享，歡迎加下面微信交流，一起學(xué)習(xí)，共同進(jìn)步！

當(dāng)然，看完如果有收獲，也歡迎關(guān)注轉(zhuǎn)發(fā)，我是小諾，一個(gè)講干貨的實(shí)驗(yàn)員！咱們下期見！

參考文獻(xiàn)

《自動(dòng)組織脫水機(jī)乙醇濃度變化對(duì)脫水的影響及采取對(duì)策的探討》_劉瑾

《不同灌注方法及灌注量對(duì)大鼠腦組織及神經(jīng)元固定的影響》-徐一菲

《自動(dòng)組織脫水機(jī)控制程序的編制與應(yīng)用》_姚海嵩

《全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)操作方法的改進(jìn)》_李泳

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免責(zé)聲明

本方案僅用于科研實(shí)驗(yàn)，不適用于臨床。