沙門氏菌是一種兼性厭氧革蘭氏陰性棒狀細菌。沙門氏菌屬腸桿菌科，是人類和動物的一種重要的醫(yī)學病原體。在我國，由沙門氏菌引起的食物中毒占細菌性食品中毒事件的40%。沙門氏菌形成了一個復雜的細菌群，包括兩個種和六個亞種，包括超過2579個血清型。目前在沙門氏菌屬中確認有兩個種，S.enterica 和 S. bongori。沙門氏菌選擇性地靶向腫瘤組織的特性也使其成為腫瘤靶向性治療的理想載體。沙門氏菌作為一個胞內(nèi)寄生菌, 具有在腫瘤組織內(nèi)高效地復制和有效抑制腫瘤生長的特性。它在基因工程改造后可以作為腫瘤基因治療的載體在肝癌、胃癌、大腸癌等的體內(nèi)外應用。

沙門氏菌與腫瘤治療

1.減毒沙門氏菌直接抗腫瘤治療:

針對沙門氏菌可以有效抑制腫瘤生長的特性，科學家利用多種基因工程技術對沙門氏菌的染色體基因組進行改造, 可以實現(xiàn)沙門氏菌的毒力減弱，從而得到減毒的菌株, 在降低對宿主致病力的同時, 依舊讓其保有高度的免疫原性, 從而確保了臨床應用的安全性。

研究表明, 減毒沙門氏菌有較好的靶向定植性, 對腫瘤有直接的溶瘤作用。利用減毒沙門氏菌定向選擇性地在腫瘤組織內(nèi)復制、增殖, 可有效抑制多重腫瘤細胞的生長, 延長動物存活時間。

2. 作為腫瘤基因治療載體:

減毒沙門氏菌可攜帶外源基因、細胞因子、外源效應蛋白等治療腫瘤。細胞因子可通過直接殺傷腫瘤細胞而起到抗腫瘤作用。外源效應蛋白能經(jīng)過減毒沙門氏菌有效地傳遞并且表達出治療性蛋白。

沙門氏菌敲除phoP基因，構建減毒沙門氏菌，提高沙門氏菌治療腫瘤的安全性

科學家使用基因剪接PCR方法聯(lián)合λ-Red系統(tǒng)去刪除野生型鼠傷寒沙門氏菌的phoP基因。這種phoP基因是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，也是在生物適應內(nèi)環(huán)境和巨噬細胞內(nèi)存活中起關鍵作用的兩個組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的組成。它還控制了鼠傷寒沙門氏菌致病所需的40多個基因的表達，以及對宿主體內(nèi)的不良環(huán)境如胃的低pH值、膽鹽、小腸的低氧和上皮細胞上的陽離子抗菌肽的抵抗能力。?鼠傷寒沙門氏菌phoP基因的破壞，導致其無法在噬菌細胞內(nèi)存活，并增加了其對宿主壓力因素的敏感性，從而達到減毒的作用，以便開發(fā)更安全的細菌治療方法。

研究者采用SOEing PCR法和western blot方法對鼠傷寒沙門氏菌的野生型和標準株進行了phoP基因的破壞。采用3個標準PCR和1個融合PCR反應構建包含phoP基因上下游和卡那霉素盒的線性DNA。使用了攜帶卡那霉素基因的pKD4作為模板質(zhì)粒，其側邊為FRT (FLP識別靶標)位點。將得到的結構電穿孔成鼠傷寒的感受態(tài)細胞。PCR驗證后確認，卡那霉素基因已經(jīng)取代了PhoP基因。因此，通過敲除Phop基因成功構建減毒沙門氏菌。

基因編輯細菌，給科學研究、臨床醫(yī)療、農(nóng)業(yè)工業(yè)生產(chǎn)帶來無限可能！

基因敲除已被應用于許多目的，如研究基因功能、疫苗生產(chǎn)和提高對蛋白質(zhì)的結構或表達的研究。目前，運用較廣的傳統(tǒng)基因編輯方法包括使用R6K自殺質(zhì)粒、λ-Red系統(tǒng)。

盡管λ-Red系統(tǒng)看似簡單且已經(jīng)被成功應用于大腸桿菌和其他革蘭氏陰性菌，但是由于菌的內(nèi)在本質(zhì)差異，這個系統(tǒng)在不同的菌中的表現(xiàn)不一樣。此外，自殺質(zhì)粒載體存在宿主范圍狹窄、抗性殘留等缺點。傳統(tǒng)的基因敲除技術存在后期篩選工作量大（周期），重組效率低，殘留loxP或FRT位點等缺點。

CRISPR/Cas9技術是近年來發(fā)展最迅速的基因編輯技術，但是由于細菌內(nèi)缺乏修復系統(tǒng)，使用此技術編輯基因的微生物種類不多。?源井生物另辟蹊徑，獨創(chuàng)了CRISPR-B?技術，CRISPR-B?技術作為一種高效的基因組編輯技術，具有操作簡單、靶向性強、脫靶率低、無痕等諸多優(yōu)勢?？蓪Ω鞣N細菌進行高效基因編輯，效率超傳統(tǒng)方法20倍以上，可快速實現(xiàn)細菌的敲除，點突變或敲入。

沙門氏菌靶向CTNNB1基因的shRNA表達，建立抑制腫瘤的新工具

細菌治療在臨床上治療腹瀉、腸易激綜合征、炎癥性腸病等胃腸疾病有良好的安全性。對于可以在實體腫瘤內(nèi)浸潤和復制的各種非致病性厭氧菌，可用于研發(fā)針對人體實體瘤的療法。核糖核酸干擾（RNAi）已被確立為一種重要的研究工具，具有巨大的基因治療潛力?？茖W家將細菌治療和RNAi治療相結合，開發(fā)了細菌介導的RNAi，將表達shRNA的載體遞送到靶細胞中，從而沉默致病基因。

與對照細胞相比，SW480細胞中CTNNB1基因沉默可顯著降低細胞增殖和死亡。

同時，通過構建SW480移植腫瘤模型，驗證在體內(nèi)沙門氏菌介導的CTNNB1基因沉默對腫瘤發(fā)育的抑制。BALB/c雌性小鼠被隨機分為三組，分別接受磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)、SL-Psls-TAT和SL-pSLS-huCAT接種。然后記錄兩周內(nèi)各組腫瘤的生長情況以及每個腫瘤中CTNNB1及其下游靶基因c-Myc和cyclin D1的表達。在SW480移植腫瘤模型中，與PBS對照組相比，SL-pSLS-huCAT處理的移植瘤生長降低了65%，與SL-pSLS-TAT處理的移植瘤生長降低了45%。同時，在這些腫瘤中檢測出CTNNB1、c-Myc和cyclin D1水平均降低。因此，?SL-pSLS-CAT介導的CTNNB1敲低顯著降低了SW480移植瘤小鼠的腫瘤生長?。隨后，通過APCmin小鼠口服SL-pSLS-mCAT，檢測表達CTNNB1 shRNA 的沙門氏菌能否抑制息肉的生長。發(fā)現(xiàn)SL-pSLS-mCAT降低了小腸CTNNB1 mRNA水平34%、息肉73%和粘膜組織83%,相比于SL-pLSLS-TAT注射組。?SL-pSLS-CAT治療也導致這些基因在小鼠息肉、粘膜組織和小腸中表達水平降低。

這些數(shù)據(jù)表明，?表達shRNA的減毒沙門氏菌可能是體外基因沉默、功能基因組學和基于RNAi抗癌或人體免疫缺陷病毒療法的發(fā)展的一個強大的新工具。

源井生物擁有豐富的沙門氏菌基因編輯和外源基因表達的經(jīng)驗，獨創(chuàng)的CRISPR-B?技術，可對各種沙門氏菌進行高效基因編輯，效率超超傳統(tǒng)方法?20倍?以上，可快速實現(xiàn)細菌的敲除，點突變或敲入！?立即聯(lián)系我們，了解更多與您的研究相關的服務！

參考文獻：
1.A. Andino and I. Hanning.Review Article Salmonella enterica
: Survival, Colonization, and Virulence Differences among Serovars.2015.e Scientifific World Journal.
3.朱曉舟, 孔桂美, 萬 丹, 孫國壯, 焦紅梅, 陰銀燕, 李國才.減毒沙門氏菌在消化系腫瘤中的研究進展.2017.世界華人消化雜志.1480-1485
4.H Guo, J Zhang and C Ina.Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi.Gene Therapy.2011.18:95-105
5.Ahani Azari, A. Zahraei Salehi, T. Nayeri FasaeiB.and Alebouyeh, M..Gene disruption in Salmonella typhimurim by modified λ Red disruption system. Iranian Journal of Veterinary Research ,Shiraz University.2015.52:301-305