今天給同學們分享一篇多熱點機制+預后+實驗的生信文章“Identification and validation of a prognostic signature of autophagy, apoptosis and pyroptosis-related genes for head and neck squamous cell carcinoma: to imply therapeutic choices of HPV negative patients”，這篇文章于2023年1月10日發(fā)表在Front Immunol期刊上，影響因子為8.786。

人乳頭瘤病毒（HPV）陽性的HNSCC患者通常具有良好的生存率，并對放療、化療放療和檢查點阻斷有良好的反應。然而，HPV陰性患者，也就是大多數(shù)HNSCC患者，一直被忽視。細胞死亡已經(jīng)與癌癥治療抵抗有關。為此，作者旨在確定自噬、凋亡和焦亡相關基因與HNSCC預后的關聯(lián)，并構建一個預后標志來預測HNSCC的預后，特別是HPV陰性的HNSCC。

1. 與頭頸部鱗狀細胞癌患者的總體生存相關的自噬、凋亡和焦亡相關基因

作者在TCGA數(shù)據(jù)集中使用單變量Cox回歸分析篩選了48個與整體生存相關的自噬、凋亡和焦亡相關基因。與上述基因的臨床病理特征相關的特征顯示在圖1A中。使用LASSO回歸模型選擇了27個基因，使用逐步多元Cox回歸模型選擇了16個基因。這16個與整體生存相關的基因包括五個與凋亡相關的基因（BCAP31、CDKN2A、FNTA、STK24和YWHAQ）、十個與自噬相關的基因（ATG5、CSNK2A2、DYNC1I1、MVB12A、MVB12B、RRAGA、TSG101、PRKN、VDAC1和VPS37C）以及一個與焦亡相關的基因（NLRP1）（圖1B）。隨后作者分析了這些與整體生存相關的基因之間的相關性（圖1C）。STK24與YWHAQ呈正相關，與MVB12A呈負相關，而DYNC1I1與PRKN呈正相關，相關系數(shù)絕對值超過0.4。

圖1 整體生存相關的自噬、凋亡和焦亡相關基因的鑒定

2. 細胞死亡指數(shù)是頭頸部鱗狀細胞癌患者總體生存的獨立預后指標

基于16個與總生存相關的基因，作者建立了自噬、凋亡和焦亡指數(shù)以及綜合細胞死亡指數(shù)（CDI）。TCGA數(shù)據(jù)集中，CDI得分高的HNSCC患者的總生存率較差（中位數(shù)為20個月，95%置信區(qū)間[CI]為18至29個月），與CDI得分低的患者相比（中位數(shù)為110個月，95% CI為90個月至未達到）。這一發(fā)現(xiàn)在GEO數(shù)據(jù)集（GSE42743和GSE65858）以及山東大學齊魯醫(yī)院的數(shù)據(jù)集中得到了進一步驗證（圖2A）。類似的趨勢也在CDI得分高的患者中觀察到，他們的總生存率較差，與CDI得分低的患者相比（分別為GSE42743中的中位數(shù)11個月對35個月，GSE65858中的57個月對62個月，以及齊魯醫(yī)院隊列中的24個月對未達到）。

圖2 CDI是HNSCC整體生存率的獨立預后指標

ROC分析顯示，CDI在預測一年、三年、五年和十年總生存期方面表現(xiàn)出色，其ROC曲線下面積（AUC）分別為0.773、0.779、0.739和0.791（圖2E）。自噬指數(shù)、凋亡指數(shù)、火凝亡指數(shù)和16個總生存期相關基因的AUC低于CDI。此外，CDI對于預測五年總生存期的AUC高于其他潛在的生存相關因素，包括年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期、腫瘤分級和HPV狀態(tài)（圖2F）。在單因素Cox回歸模型中，CDI、凋亡指數(shù)和自噬指數(shù)與不良預后相關，而火凝亡指數(shù)與良好預后相關（危險比[HR]為4.00，95% CI為2.90-5.70，P <0.001，分別為CDI，HR為2.60的凋亡指數(shù)，HR為3.60的自噬指數(shù)和HR為0.61的火凝亡指數(shù)，圖2G）。在多因素Cox回歸模型中，CDI是獨立的總生存期預后指標，在調(diào)整年齡、性別和TNM分期后（HR為3.80，95% CI：2.70-5.40，P <0.001，圖2G）。

作者還基于多變量Cox模型開發(fā)了一個基于TCGA數(shù)據(jù)集的圖表模型，用于預測HNSCC患者一年、三年和五年的總體生存概率（圖2H）。該圖表顯示，CDI是最大的貢獻因素，其次是年齡、TNM分期和腫瘤分級。在校準圖中，觀察到的和圖表預測的總體生存曲線非常吻合（圖2I）。作者的圖表模型表現(xiàn)可靠，具有0.735的一致性指數(shù)（C-index）。

3. CDI對HPV陰性的頭頸部鱗狀細胞癌患者具有更強的預后效果，高CDI頭頸部鱗狀細胞癌患者通過放療獲得生存益處

作者進一步研究了CDI對整體生存率的影響，根據(jù)基線因素和其他已知影響生存率的因素，在TCGA數(shù)據(jù)集中進行了分層分析（圖3A、B）。在除HPV陽性HNSCC患者外的所有亞組中，發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢。這一有趣的發(fā)現(xiàn)解決了作者對HPV狀態(tài)分層的關注，尤其是對于大多數(shù)HNSCC，即HPV陰性患者。

圖3 CDI對HPV陰性HNSCC患者顯示出更強的預后效應，并與放療的生存益處相關

為了評估高或低CDI分數(shù)的HNSCC患者是否從放療或化療放療中獲得不同的生存益處，作者使用TCGA數(shù)據(jù)集分析了高和低CDI HNSCC患者根據(jù)輔助治療分層的總體生存概率（圖3C，D）。在接下來的分析中，只有一個接受單獨化療的患者被排除在外。接受放療的HNSCC患者在高CDI亞組中顯示出良好的總體生存率，但在低CDI亞組中沒有（P = 0.009和P = 0.938，分別，圖3C）。值得注意的是，在HPV陰性亞組（P = 0.059，圖3D）和HPV陽性患者（P = 0.045）中也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，盡管高CDI分數(shù)的HPV陰性患者表現(xiàn)出最差的預后，但他們?nèi)钥赡軓姆暖熤蝎@得總體生存益處。

4. 低CDI HNSCC患者在HPV陰性HNSCC亞組中表現(xiàn)出活躍的免疫微環(huán)境

作者使用TCGA數(shù)據(jù)集評估了高和低CDI HNSCC患者的免疫環(huán)境。低CDI評分的HPV陰性HNSCC患者顯示出更高的免疫評分和微環(huán)境評分（圖4A）。然而，在HPV陽性患者中，高CDI和低CDI亞組之間的上述評分差異并未發(fā)現(xiàn)。為了評估具有不同CDI評分的HNSCC患者的免疫細胞浸潤情況，作者應用了去卷積算法（圖4B，S5C）。在HPV陰性和陽性HNSCC患者中，高CDI亞組中的靜息記憶CD4 T細胞和M0巨噬細胞浸潤更高。然而，在HPV陰性HNSCC亞組中，只有低CDI亞組中才有更多的原始B細胞、CD8 T細胞、活化記憶CD4 T細胞、濾泡輔助T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞和靜息肥大細胞。

圖4 高和低CDI HNSCC在HPV陰性亞組之間的免疫景觀

此外，為了評估CDI評分在免疫檢查點阻斷中的潛在療效，作者使用TCGA數(shù)據(jù)集檢查了HNSCC患者高CDI亞組和低CDI亞組之間14個關鍵免疫檢查點基因的表達情況。作者發(fā)現(xiàn)，在HPV陰性的HNSCC患者中，CTLA4、IDO1、TIM3、LAG3、PD1、SIGLEC10、LILRB1和NKG2A的表達在低CDI亞組中增加（圖4C），但在HPV陽性的HNSCC患者中沒有增加。這表明，CDI評分低的HPV陰性患者可能會從檢查點阻斷治療中獲益。

5. 低CDI HNSCC患者在HPV陰性HNSCC亞組中顯示了與免疫功能相關通路的基因富集

考慮到CDI對HPV陰性和HPV陽性患者的不同預后影響，以及HPV陰性HNSCC患者中高CDI和低CDI亞組之間的不同免疫微環(huán)境，作者進一步分析了具有不同CDI評分的HPV陰性HNSCC患者的差異表達基因。共鑒定出288個差異基因，其中51個基因在高CDI亞組中上調(diào)表達，237個基因在高CDI亞組中下調(diào)表達（圖5A）。

圖5 不同CDI評分的HPV陰性HNSCC患者的功能豐富性

GO富集分析顯示，低CDI亞組中上調(diào)基因主要富集在與免疫功能相關的通路中，包括免疫系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)、淋巴細胞激活、免疫應答調(diào)節(jié)、淋巴細胞激活調(diào)節(jié)、B細胞激活、B細胞分化和B細胞增殖。然而，高CDI亞組中上調(diào)基因很少富集在與免疫功能相關的通路中（圖5B、C）。

KEGG富集分析顯示，高CDI亞組中上調(diào)基因主要富集在與代謝相關的途徑中，包括色氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、酪氨酸代謝和苯丙氨酸代謝。而低CDI亞組中上調(diào)基因主要富集在與免疫功能相關的途徑中，包括細胞因子-細胞因子受體相互作用、抗原處理和呈遞、自然殺傷細胞介導的細胞毒作用和T細胞受體信號通路（圖5D、E）。

6. 兩個HPV陰性HNSCC細胞系中與總生存相關的十六個基因的表達

為了驗證數(shù)據(jù)庫分析的結果，作者使用qRT-PCR測量了兩種HPV陰性HNSCC細胞（CAL27和SCC-15）中與總體生存相關的16個基因的基線mRNA表達水平（圖6A）。在自噬抑制劑氯喹（CQ）的作用下，CAL27和SCC-15細胞的細胞存活率顯著受到抑制（圖6B）。此外，作者發(fā)現(xiàn)CQ在兩種細胞系中誘導了凋亡（圖6C，D）。自噬相關蛋白（LC3和p62）在CQ的作用下被誘導，bcl-2減少，caspase-3被剪切，表明CQ可能抑制自噬并誘導凋亡（圖6E）。除了兩個低表達基因（PRKN和MVB12B）外，上述與總體生存相關的基因在CAL27細胞系中在CQ處理后均被誘導。在SCC-15細胞系中，DYNC1I1、CSNK2A2和TSG101在CQ處理后被誘導，MVB12A減少（圖6F）。

圖6 驗證16個與總生存相關基因在兩種HPV陰性HNSCC細胞系中的表達情況

7. 輻射誘導HPV陰性HNSCC細胞系中的細胞凋亡和VDAC1表達

作者進一步確定了一個不同表達的基因VDAC1，在HPV陰性HNSCC患者的輻射敏感和輻射耐受亞組之間（圖7A）。VDAC1的表達在輻射敏感亞組中顯著降低。體外實驗中，CQ和/或輻射顯著抑制了CAL27和SCC-15細胞系的細胞存活率（圖7B）。作者進一步發(fā)現(xiàn)，CQ和/或輻射誘導了CAL27和SCC-15細胞系的凋亡（圖7C，D）。此外，VDAC1在CQ和/或輻射處理后在CAL27和SCC-15細胞系中被誘導表達（圖7E）。

圖7 輻射增強了HPV陰性HNSCC細胞系中VDAC1的表達

總結

總之，作者確定了16個與自噬、凋亡和焦亡相關的基因，并構建了一個細胞死亡指數(shù)（CDI），CDI能夠獨立預測HNSCC患者的預后。CDI得分高的HNSCC患者可能會從放療中受益，而HPV陰性且CDI得分低的患者可能會從檢查點免疫療法中獲得潛在的益處。作者的研究結果不僅建立了一個預后標志，還強調(diào)了它在HPV陰性HNSCC患者中的治療選擇的實施，這是HNSCC的大多數(shù)患者和預后不良的人群。