基本信息

中文標(biāo)題：MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR模塊調(diào)節(jié)蘋果光誘導(dǎo)過程中花青素和木質(zhì)素生物合成之間的穩(wěn)態(tài)

研究對象：蘋果

發(fā)表期刊：New Phytologist

影響因子：10.323

發(fā)表單位：北京林業(yè)大學(xué)北京林木分子設(shè)計育種高精尖創(chuàng)新中心；北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；北京市農(nóng)業(yè)應(yīng)用與新技術(shù)重點實驗室

運用生物技術(shù)：qRT-PCR，農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)，生物膜干涉技術(shù)Biolayer interferometry (BLI)、轉(zhuǎn)錄組測序、small RNA測序

研究背景

光是影響蘋果果實發(fā)育、成熟和衰老的重要信號和環(huán)境因子之一，并在果實次生代謝物質(zhì)合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。光信號激活蘋果果實花色苷合成，從而影響果實的色澤和外觀品質(zhì)。木質(zhì)素和花色苷含量的多少是影響蘋果食用品質(zhì)和外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)。然而，對于蘋果果皮在光誘導(dǎo)過程中著色與木質(zhì)化的關(guān)系及相互作用的研究卻很少。本研究前期發(fā)現(xiàn)，蘋果果皮花色苷含量在果實脫袋之后顯著升高，而木質(zhì)素含量在脫袋之后顯著降低。然而，在光誘導(dǎo)條件下，兩者之間是否產(chǎn)生相互作用而影響蘋果脫袋后的品質(zhì)發(fā)育尚不清晰。

研究路線

研究方法

1.實驗分組/研究材料

（1）套袋組（黑暗處理，對照）：采后套袋蘋果。

（2）弱光處理組（處理一）：采后套袋蘋果，去除袋子，用硫酸鹽紙袋包裝。

（3）強(qiáng)光處理組（處理二）：采后套袋蘋果，去除袋子。

（4）處理時間：在處理后0、2、4、6和15 d，取樹周大小相近的蘋果果實果皮進(jìn)行取樣。

2.技術(shù)路線

2.1 轉(zhuǎn)錄組和miRNA組分析：取光照處理2 d的蘋果果皮樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和miRNA組測序。

2.2 花青苷和木質(zhì)素含量分析：測定對照組，處理一和處理二蘋果果皮花青苷和木質(zhì)素含量。

2.3 基因相對表達(dá)量變化分析：計算木質(zhì)素和花青苷代謝通路關(guān)鍵基因在對照組，處理一和處理二中的相對表達(dá)量。

2.4 miR7125靶向MdCCR關(guān)系分析：5‘RACE

2.5 miR7125和MdCCR功能分析：農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)蘋果

2.6 miR7125啟動子功能分析：生物膜干涉技術(shù)Biolayer interferometry (BLI)

研究結(jié)果

1. 不同光強(qiáng)處理后蘋果果實顏色的表征

如圖1所示，光照處理顯著促進(jìn)蘋果果皮花青苷積累，且積累量隨光強(qiáng)增加而增加，木質(zhì)素含量則隨光強(qiáng)增加而減少。光照處理下，蘋果中花青苷合成關(guān)鍵基因 的相對表達(dá)量隨光強(qiáng)增加而增加；而木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因和相對表達(dá)量隨光強(qiáng)增加而減少。

圖1 | 不同光強(qiáng)處理后蘋果果實著色特性

2. 不同光強(qiáng)處理下蘋果花瓣、葉片、綠皮、果肉和果皮中miR7125和MdCCR表達(dá)水平的qRT-PCR分析

如圖2所示，隨著光照強(qiáng)度增加，mdm-miR7125相對表達(dá)量顯著升高，MdCCR（肉桂酰輔酶A還原酶基因）的相對表達(dá)量顯著降低。隨著蘋果花從芽到盛花發(fā)育階段，花青苷含量逐漸降低，mdm-miR7125相對表達(dá)量顯著降低，MdCCR的相對表達(dá)量顯著升高。mdm-miR7125和MdCCR在蘋果葉的表達(dá)量顯著高于綠色表皮和果肉。

圖2 | 不同光強(qiáng)處理下蘋果花瓣、葉片、綠皮、果肉和果皮中miR7125和MdCCR表達(dá)水平的qRT-PCR分析

3. 蘋果果實中miR7125和MdCCR表達(dá)的鑒定

如圖3所示，RLM-RACE結(jié)果表明MdCCR是miR7125的直接靶標(biāo)，其裂解位點位于互補(bǔ)區(qū)域內(nèi)的第4和第5堿基之間(圖3a,b)。MdCCR基因的CDS，全長648 bp，編碼215個氨基酸(與金香蘋果中已發(fā)表的MdCCR序列一致)，包含3個保守基序，包括CCR超家族的碳域和硫氧還蛋白超家族的氮域(圖3c,d)。如圖3(e)結(jié)果顯示， PbCCR與MdCCR關(guān)系密切，一致性為98%。

圖3 | 蘋果果實中miR7125和MdCCR表達(dá)的鑒定與表征

4. 在摘袋后的套袋蘋果中過表達(dá)mdm-miR7125和干擾MdCCR功能分析

如圖4所示，在收獲的套袋蘋果摘袋后，分別過表達(dá)mdm-miR7125，干擾MdCCR表達(dá)，以及同時過表達(dá)mdm-miR7125和干擾MdCCR表達(dá)，蘋果表皮花青苷顯著積累，木質(zhì)素含量顯著下降。在這三種處理條件下，MdCHS等花青苷合成關(guān)鍵基因顯著上調(diào)表達(dá)，MdF5H等木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因顯著下調(diào)表達(dá)。

圖4 | NILTeo和NILB73的氮素利用率

5. 在摘袋后的套袋蘋果中干擾mdm-miR7125和過表達(dá)MdCCR功能分析

如圖5所示，在收獲的套袋蘋果摘袋后，分別干擾mdm-miR7125表達(dá)，過表達(dá)MdCCR，以及同時干擾mdm-miR7125表達(dá)和過表達(dá)MdCCR，蘋果表皮木質(zhì)素顯著積累，花青苷含量顯著下降。在這三種處理條件下，MdCHS等花青苷合成關(guān)鍵基因顯著下調(diào)表達(dá)，MdF5H等木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因顯著上調(diào)表達(dá)。

圖5 | 套袋蘋果果實采收后MIM7125、CCR-OX、miR7125-RNAi、CCR-OX、miR7125-RNAi + CCR-OX、MIM7125 + CCROX的瞬時轉(zhuǎn)化特征

6.MdMYB16和MdMYB1能夠結(jié)合mdm-miR7125的啟動子

如圖6所示，套袋蘋果摘袋后，MdMYB16的表達(dá)量隨光強(qiáng)增強(qiáng)而顯著降低；MdMYB1的表達(dá)量隨光強(qiáng)增強(qiáng)而顯著升高。相關(guān)性分析表明，MdMYB16與木質(zhì)素，花青苷，mdm-miR7125和MdCCR呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；MdMYB1與木質(zhì)素，花青苷，mdm-miR7125和MdCCR呈顯著正相關(guān)關(guān)系。生物膜干涉技術(shù)Biolayer interferometry (BLI)結(jié)果表明，MdMYB16和MdMYB1主要結(jié)合在mdm-miR7125啟動子的“CAACAG”元件（MYB結(jié)合位點，MBS）位置。

圖6 | 蘋果中MdMYB16和MdMYB1與miR7125啟動子結(jié)合

7.在摘袋后的套袋蘋果中過表達(dá)和干擾MdMYB16功能分析

如圖7所示， 在收獲的套袋蘋果摘袋后，過表達(dá)MdMYB16，蘋果表皮木質(zhì)素顯著積累，花青苷含量顯著下降；其中，MdCHS等花青苷合成關(guān)鍵基因顯著下調(diào)表達(dá)，MdF5H等木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因顯著上調(diào)表達(dá)。在收獲的套袋蘋果摘袋后，干擾MdMYB16表達(dá)，蘋果表皮花青苷顯著積累，木質(zhì)素含量顯著下降；其中，MdCHS等花青苷合成關(guān)鍵基因顯著上調(diào)表達(dá)，MdF5H等木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因顯著下調(diào)表達(dá)。

圖7 | 蘋果采收后套袋后MYB16-OX和MYB16-RNAi的果實表型、qRT-PCR分析、果皮花青素含量、果皮木質(zhì)素含量、花青素通路相關(guān)基因等表達(dá)變化特征

8.?MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR模塊調(diào)控蘋果光誘導(dǎo)過程中花青素和木質(zhì)素生物合成的內(nèi)穩(wěn)態(tài)

如圖8所示，光照條件下，蘋果表皮中MdMYB1表達(dá)量升高，MdMYB16表達(dá)量下降，使更多的MdMYB1結(jié)合在mdm-MIR7125的啟動子MBS元件上，從而激活mdm-miR7125的表達(dá)使其表達(dá)量升高，進(jìn)一步靶向降解木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因MdCCR，最終降低蘋果果皮中木質(zhì)素的合成，促進(jìn)花青苷積累。黑暗條件下，蘋果果皮細(xì)胞中MdMYB16表達(dá)量升高，直接導(dǎo)致mdm-miR7125的表達(dá)量降低，MdCCR表達(dá)量升高，最終導(dǎo)致木質(zhì)素含量升高，花青苷合成通路被抑制。

圖8 | MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR模塊調(diào)節(jié)蘋果果實光誘導(dǎo)過程中花青素和木質(zhì)素積累平衡的機(jī)制工作模型

研究結(jié)論

當(dāng)果實感知光信號時，調(diào)控花青素生物合成的激活子MdMYB1和抑制子MdMYB16的表達(dá)分別顯著上調(diào)和下調(diào)。導(dǎo)致了miR7125的上調(diào)和蘋果花青素的積累。此外，MdCCR轉(zhuǎn)錄水平受miR7125調(diào)控，顯著降低，導(dǎo)致木質(zhì)素生物合成降低。最后，相對較多的底物和通量從木質(zhì)素途徑轉(zhuǎn)向花青素的生物合成，導(dǎo)致蘋果變色。綜上所述，姚允聰團(tuán)隊的研究揭示了由MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR模塊驅(qū)動的蘋果光誘導(dǎo)過程中花青素和木質(zhì)素合成之間的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制。同時也強(qiáng)調(diào)了未來利用代謝靈活性調(diào)節(jié)果實特定品質(zhì)的可能性和可行性。

文章推薦

姚允聰團(tuán)隊作為國內(nèi)蘋果花青苷合成通路相關(guān)研究的領(lǐng)軍人物，為該領(lǐng)域的豐富貢獻(xiàn)了不可小覷的力量。miRNA作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的明星分子，在得到越來愈多的研究。這篇文章從常規(guī)的蘋果種植工藝——“套袋”著手，先是闡明了光照強(qiáng)度對蘋果果皮著色的影響，后結(jié)合miRNA測序和轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了能夠靶向調(diào)控木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因——肉桂酰輔酶A還原酶基因（MdCCR）的mdm-miR7125，以及一個轉(zhuǎn)錄抑制子MdMYB16，首次提出了MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR模塊驅(qū)動的蘋果光誘導(dǎo)過程中花青素和木質(zhì)素合成之間的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制。

不僅如此，該研究表明，miRNA不僅可以靶向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，也可以靶向調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因。生物膜干涉技術(shù)Biolayer interferometry (BLI)技術(shù)的應(yīng)用也拓寬了小分子與啟動子結(jié)合的研究方法。總的來說，該文章的研究結(jié)果為指導(dǎo)蘋果生產(chǎn)實踐中果實著色以及豐富非編碼RNA在細(xì)胞色素合成領(lǐng)域的理論研究都具有重要意義。

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(轉(zhuǎn)錄組測序、small RNA測序)

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