前言

2022年12月3日，在頭頸腫瘤的PD-1/L1靶向治療研究領域，南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院丁亮副研究員、泥艷紅教授和王志勇教授合作團隊在國際腫瘤學期刊British Journal of Cancer（影響因子: 9.075，中科院一區(qū)）上在線發(fā)表題為“IL-33/ST2 signaling promotes constitutive and inductive PD-L1 expression and immune escape in oral squamous cell carcinoma”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)了一類具有較高臨床響應率的口腔鱗癌（OSCC）亞型，從基因?qū)用娼沂玖嘶颊逷D-1/L1治療應答的差異，并提出了依據(jù)IL-33/ST2信號對OSCC進行分子分型，利用人源化小鼠模型以期篩選潛在的具有較高PD-L1免疫治療應答率的腫瘤類型，指導臨床治療策略制定及療效預測。

研究背景

程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1,PD-1)是一種重要的免疫抑制分子，基于PD-1/PD-L1制備的免疫抑制劑已經(jīng)徹底改變了晚期頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的系統(tǒng)性治療。但關于腫瘤PD-L1調(diào)控的分子作用機制目前還未研究清楚。研究團隊長期致力于腫瘤微環(huán)境的解析及靶向治療研究，前期研究揭示了腫瘤間質(zhì)成纖維細胞（CAFs）異質(zhì)性是OSCC患者進展和術后復發(fā)的重要影響因素（Carcinogenesis. 2018;39(3):397-406. Nature Communications. 2022;13(1):5124.）。在此基礎上，前期作者報道過成纖維細胞（CAF）來源的白細胞介素-33（IL-33，IL-1家族成員）可促進口腔鱗癌患者中間質(zhì)成纖維細胞的活化和腫瘤細胞的增殖從而促進OSCC的進展，其作用是通過與IL-33受體ST2的相互作用來激活免疫系統(tǒng)以應對組織損傷，而通過PD-1/L1調(diào)節(jié)T細胞應答的CAFs/腫瘤細胞相互作用是免疫抑制的關鍵調(diào)控因子。然而，目前對于IL-33/ST2信號軸在OSCC微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)作用尚不清楚。

本研究旨在通過體外分離人外周血單核細胞建立ST2 OSCC/T細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，體內(nèi)構(gòu)建人源化小鼠模型，探究IL-33及其受體ST2信號在PD-L1陽性OSCC患者中的免疫調(diào)節(jié)作用，檢驗ST2是否可作為PD-L1/PD-1治療OSCC患者的潛在療效預測因子。

研究結(jié)果

1. OSCC組織中IL-33/ST2高表達與原位和血液中CD8 T細胞浸潤較少有關

通過TNMplot數(shù)據(jù)庫分析了IL-33和ST2在HNSCC和OSCC患者腫瘤組織和正常組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)在HNSCC患者中，腫瘤組織中ST2的表達明顯高于正常組織（圖1a）；IL-33在OSCC的腫瘤組織中也表達上調(diào)，并在腫瘤轉(zhuǎn)移生態(tài)位中富集（圖1b）；進一步分析IL-33和ST2對HNSCC患者預后的影響時發(fā)現(xiàn)ST2高表達的患者，其總生存期較短（圖1d），而IL-33高表達患者的總生存期比IL-33低表達的患者更短（圖1e）。免疫組化IHC染色證明ST2和IL-33并在癌變細胞中表達上調(diào)而在正常上皮細胞中表達缺失，在OSCC中，ST2主要在腫瘤細胞中表達，IL-33則在CAFs和血管內(nèi)皮細胞中顯示出更多的基質(zhì)表達（圖1c）。此外，基于TIMER2.0數(shù)據(jù)庫進一步評估HNSCC患者中IL-33/ST2表達與CD4或CD8 T細胞表達的相關性，結(jié)果顯示：在腫瘤微環(huán)境中，ST2/ IL-33的表達與CD4 T細胞和CD8 T細胞的浸潤呈顯著負相關（圖1f，g）。分析OSCC患者血液中關鍵免疫細胞比例和數(shù)量時顯示：高表達ST2的患者血液中CD3CD8 細胞毒性 T細胞的比例和數(shù)量相對較低（圖1h-j）。

圖1 I L-33/ST2與T細胞原位活化和血液活化的相關性

2. IL-33/ST2信號促進口腔鱗癌細胞中PD-L1的表達

為了揭示ST2與活化T細胞減少之間的潛在聯(lián)系，通過慢病毒-shRNA-ST2轉(zhuǎn)染Cal27、HN6和Hsc3 OSCC細胞系，獲得了3個ST2穩(wěn)定敲除的細胞系。通過WB驗證了基因敲除效率（圖2a)；通過構(gòu)建含有PD-L1啟動子區(qū)域的熒光素酶質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)在ST2敲低的腫瘤細胞中，熒光素酶活性顯著降低（圖2b）；3個細胞系的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示CD274（編碼PD-L1）在ST2敲低細胞系中顯著降低（圖2c）；與先前研究結(jié)果一致，ELISA實驗也證實了CAFs中IL-33的表達顯著高于正常成纖維細胞（圖2d）。在重組人源IL-33細胞因子刺激后，過表達ST2（ST2OE）HN6細胞系的CD274表達顯著上調(diào)，說明ST2的激活對于PD-L1表達來說是必需的（圖2e）。為了進一步明確ST2和PD-L1在OSCC組織中的原位共表達關系，對10個冷凍的OSCC組織切片進行了免疫熒光染色，pan- keratin腫瘤細胞顯示ST2和PD-L1陽性均被染色并共定位（圖2f）。

通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫對HNSCC患者的IL-33、ST2 和PD-L1 進行相關性分析發(fā)現(xiàn)IL-33和ST2分別與PD-L1的表達量呈顯著正相關（圖2g）。通過從45個OSCC組織中提取RNA進行qPCR證實ST2的患者同樣也有較高的PD-L1水平（圖2h）。通過流式細胞術根據(jù)PD-L1低表達和PD-L1高表達對3種OSCC細胞系（Cal27、Scc9和Hsc3）進行了分類，結(jié)合qPCR分析顯示，ST2在PD-L1細胞中的表達量明顯低于PD-L1high的細胞（圖2i）。這些結(jié)果表明，IL-33/ST2信號可促進口腔鱗癌細胞中PD-L1的表達。

圖2 | OSCC中的IL-33/ST2信號調(diào)控PD-L1的表達

3. IL-33/ST2信號通路通過JAK/STAT3通路促進PD-L1的構(gòu)成型表達

為進一步確定在ST2腫瘤中調(diào)節(jié)PD-L1表達的關鍵通路，基于GTRD數(shù)據(jù)庫進行分析發(fā)現(xiàn)在CD274啟動子中存在幾個預測的轉(zhuǎn)錄因子（TFs）結(jié)合位點。通過對這些轉(zhuǎn)錄因子進行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)JAK/STAT通路顯著富集（圖3a）。通過WB檢測ST2敲低細胞中JAK2和STAT3的激活狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)ST2被抑制后，JAK2和STAT3的磷酸化水平均降低（圖3b），而刺激IL-33細胞因子可以顯著提高JAK2和STAT3的磷酸化水平，而敲低ST2可以直接抑制JAK2/STAT3通路的激活（圖3c）；另外，在ST2過表達的OSCC細胞系中，JAK2/ STAT3的磷酸化水平增強（圖3d）。為了證實JAK/STAT通路在PD-L1轉(zhuǎn)錄中的作用，用JAK2抑制劑AG490對細胞進行了處理，結(jié)果顯示，AG490抑制劑的加入逐漸降低了JAK2和STAT3的磷酸化水平，同時PD-L1的表達下調(diào)（圖3e）。

免疫熒光結(jié)果顯示，IL-33刺激增強了PD-L1的表達和p-STAT3的細胞核染色（圖3f）。為了進一步研究IL-33/ ST2/PD-L1通路，將HN6 OSCC細胞系與IL-33在超低粘附環(huán)境中進行共培養(yǎng)，形成3D腫瘤類器官（圖3g），免疫熒光染色結(jié)果表明，激活IL-33/ST2信號可激活p-STAT3的核定位，從而增加PD-L1的表達（圖3h)。

圖3 | JAK2/STAT3通路在IL-33/ST2調(diào)控PD-L1表達中的作用

4. IL-33/ST2信號通過MyD88上調(diào)IFN-γR的表達，從而促進IFN-γ介導的PD-L1表達

基于cBioPortal數(shù)據(jù)庫中泛癌和HNSCC患者隊列的臨床數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)CD274與IFNGR呈正相關（圖4a）。RNA-seq數(shù)據(jù)表明在OSCC細胞系中ST2的敲低可下調(diào)IFNGR（圖2c）。據(jù)報道，在靶向治療過程中，PD-L1可誘導激活IFN-γ/IFN-γR，因此推測IL-33/ST2信號可能通過IFN-γR間接激活IFN-γ/PD-L1通路。qPCR結(jié)果證明ST2過表達增強了IL-33誘導的IFNGR上調(diào)表達（圖4b）。通過免疫組化和免疫熒光實驗也證實了IL-33/ST2激活對于IFN-γR水平的影響（圖4c，d）。通過qPCR實驗進一步驗證ST2下游信號分子時發(fā)現(xiàn)IL-33/ST2的激活促進了下游MYD88和TRAF6的表達（圖4e-f），通過WB實驗在蛋白層面也證實了這一點（圖4g）。另外，ST2過表達和IFN-γ刺激聯(lián)合誘導PD-L1基因和蛋白表達水平進一步升高（圖4h，i），并且這種升高與STAT3和p65的激活有關（圖4j）。因此，這些數(shù)據(jù)表明，ST2信號可以通過JAK-STAT3通路直接促進PD-L1的表達，并間接通過促進IFN-γR的表達，進一步增強IFN-γ介導的PD-L1誘導反應（圖4k）。

圖4 I L-33/ST2信號對腫瘤細胞IFN-γR/PD-L1表達的影響

5. ST2腫瘤細胞通過PD-L1抑制人CD8+ T細胞的腫瘤殺傷功能

為了評估ST2 腫瘤細胞在免疫逃逸中的作用，建立了腫瘤/免疫細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，使用磁珠、CD3/CD28激活因子和IL-2細胞因子對人外周血單核細胞中的CD8+ T細胞進行分類，刺激CD8+ T細胞增值并誘導細胞毒性T細胞（CTLs）的活化（圖5a）。T細胞介導的腫瘤細胞殺傷試驗顯示，活化的CD8+ T細胞能有效促進ST2+ 腫瘤細胞凋亡，而ST2敲低能進一步增強了ST2+ 促進的腫瘤凋亡。相反的，在HN6細胞中過表達ST2又能使腫瘤細胞對人源細胞毒性T細胞（CTLs）具有更強的抗性（圖5b，c）。同時，采用流式細胞術檢測上清中T細胞的活化率，結(jié)果顯示，與對照組相比，敲低ST2的HN6組，其CD3 CD8 T細胞和CD8IFN-γ T細胞比例顯著上調(diào)（圖5d，e）。將人外周血單核細胞（PBMCs）注射到NCG小鼠體內(nèi)建立人源化PBMC小鼠模型（hu-PBMC)（圖5f）進行進一步的體內(nèi)驗證實驗，10天后通過流式細胞術分析重建效率，結(jié)果顯示小鼠外周血中CD45 細胞的平均比例約為20-30%，人源CD45CD3T細胞富集約占80%（圖5g，h）。分別在NCG小鼠和hu-PBMC小鼠舌頭上注射人OSCC細胞系HN6進一步誘導OSCC的原位模型，發(fā)現(xiàn)只有Hu-PBMC小鼠檢測CD8+ T細胞在腫瘤中有浸潤（圖5i），采用ST2 HN6細胞進行注射時，腫瘤體積明顯小于對照組（圖5j，k）；免疫組化染色結(jié)果也顯示，ST2組腫瘤中CD3 T細胞和CD8 T細胞的浸潤率均高于對照組（圖5n）。

圖5 | ST2敲除促進了Hu-PBMC小鼠模型的體內(nèi)外人源CTL殺傷功能

6.ST2敲除聯(lián)合抗PD-L1治療在OSCC中顯示出優(yōu)越的抗腫瘤作用

以無免疫缺陷的C57BL/6小鼠為實驗對象，進一步評估抗PD-(L)1阻斷抗體存在時，IL-33/ST2信號對CD8+ T細胞的免疫抑制作用，發(fā)現(xiàn)在IL33/ST2激活的腫瘤中，抗PD-L1治療可顯著誘導腫瘤退縮，并消除ST2/PD-L1誘導的免疫抑制。對口腔鱗癌患者進行抗PD-1治療前后的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過PD-1阻斷治療后，有治療應答的患者其腫瘤表達更高水平的CD8和ST2（圖6a），通過測量腫瘤體積、統(tǒng)計細胞占比（CD8 T細胞增加和Foxp3 treg細胞減少）及免疫組化實驗進一步證明ST2敲低聯(lián)合抗PD-L1治療顯示出更優(yōu)的抗腫瘤作用（圖6b-e）。最后通過免疫組化驗證了OSCC患者原位ST2、PD-L1、IFN-γR蛋白的表達位置，結(jié)果顯示ST2高表達與PD-L1、IFN-γR高表達顯著相關（圖6f，g）。

圖6 ST2敲除聯(lián)合抗PD-L1治療在OSCC中顯示出優(yōu)越的抗腫瘤作用

研究結(jié)論

本研究通過細胞、人源化小鼠模型和OSCC及HNCSS患者的體內(nèi)外實驗，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)共同闡明了OSCC中一個基于IL-33/ST2/PD-L1的免疫調(diào)節(jié)模型，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)IL-33可以激活ST2 腫瘤細胞的JAK2/STAT3磷酸化，從而促進PD-L1的表達。另外，IL-33/ST2也可以通過MyD88/TRAF6/NF-κB信號軸激活IFN-γR的表達，從而間接刺激IFN-γ誘導的PD-L1的表達。這些結(jié)果表明IL-33/ST2信號增強了PD-L1介導的免疫逃逸，抑制ST2信號可能有益于OSCC患者的抗PD-1/L1治療。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41416-022-02090-0

DOI:10.1038/s41416-022-02090-0

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