寫在前面

????????今天推薦的是由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院上海腫瘤研究所在2021年7月28日發(fā)表于Cancer Letters（2020IF：8.680，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Yongzhong Liu教授，研究表明USP22對(duì)抑制子E2F6的去泛素化促進(jìn)肝細(xì)胞癌中的AKT激活和腫瘤生長(zhǎng)。

研究背景

????????腫瘤相關(guān)蛋白的失調(diào)泛素化在腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。去泛素化酶USP22在某些類型的癌癥中異常表達(dá)，并有助于侵襲性腫瘤進(jìn)展。然而，USP22在肝細(xì)胞癌(HCC)中促腫瘤功能的確切機(jī)制仍不清楚。

摘要部分

????????在這里，作者報(bào)告E2F6是一種蛋白口袋非依賴的轉(zhuǎn)錄抑制因子，對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要，并且其活動(dòng)受USP22介導(dǎo)的去泛素化控制。USP22與E2F6相互作用并穩(wěn)定E2F6，導(dǎo)致磷酸酶DUSP1的轉(zhuǎn)錄抑制。此外，涉及E2F6抑制DUSP1的過程增強(qiáng)了HCC細(xì)胞中的AKT激活。因此，這些發(fā)現(xiàn)提供了對(duì)USP22介導(dǎo)的致癌AKT信號(hào)控制的機(jī)制見解，強(qiáng)調(diào)了USP22-E2F6調(diào)控在HCC發(fā)展中的重要性。

研究?jī)?nèi)容

1.USP22與E2F6相互作用并穩(wěn)定E2F6??? ?

????????為了評(píng)估可能在HCC中經(jīng)歷USP22介導(dǎo)的去泛素化的蛋白質(zhì)，作者使用Huh7細(xì)胞進(jìn)行了IP-MASS分析。作者發(fā)現(xiàn)USP22免疫沉淀物中存在的三種轉(zhuǎn)錄抑制因子，即E2F6、IKZF2和E2F7，可能參與USP22-介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的抑制。TCGALIHC數(shù)據(jù)集的分析進(jìn)一步表明僅E2F6在HCC樣本和非腫瘤組織之間差異表達(dá)，表明E2F6在HCC中的臨床相關(guān)性。因此，作者驗(yàn)證了E2F6和USP22的相互作用；結(jié)果顯示E2F6是一種蛋白口袋非依賴的轉(zhuǎn)錄抑制因子，能夠與USP22相互作用，表明E2F6介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制可能與USP22在HCC中的功能有關(guān)。

????????鑒于去泛素化酶(DUB)在維持其靶蛋白穩(wěn)定性方面的功能，作者認(rèn)為USP22可能通過抑制E2F6的降解來促進(jìn)E2F6的積累。正如預(yù)期的那樣，USP22的敲低顯著降低了HCC細(xì)胞中的E2F6蛋白水平。然而，USP22下調(diào)并未減弱轉(zhuǎn)錄E2F6水平。值得注意的是，由USP22抑制引起的E2F6蛋白水平的降低可以被蛋白酶體抑制劑MG132逆轉(zhuǎn)，表明USP22通過抑制蛋白酶體機(jī)制介導(dǎo)的降解來增加E2F6的穩(wěn)定性。為了確定E2F6積累是否需要USP22的去泛素化酶活性，作者生成了USP22 C185A，USP22的酶促失活突變體，并發(fā)現(xiàn)USP22 C185A未能增加HCC細(xì)胞中E2F6的蛋白質(zhì)水平。由于K48連接的多泛素修飾與蛋白酶體依賴性降解過程相關(guān)，作者將表達(dá)E2F6、HA-泛素（WT或僅K48-linakge）和USP22的載體共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。正如預(yù)期的那樣，WT USP22，而不是USP22 C185A，減少了與E2F6蛋白綴合的WT和K48連接的多泛素鏈的數(shù)量。

研究結(jié)論：USP22介導(dǎo)的去泛素化功能對(duì)于E2F6的穩(wěn)定至關(guān)重要。

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2.在HCC中E2F6和USP22表達(dá)相關(guān)

????????為了探究USP22介導(dǎo)的E2F6穩(wěn)定性調(diào)節(jié)的臨床相關(guān)性，作者分析了USP22和E2F6蛋白在成對(duì)的人類HCC和正常組織標(biāo)本中的表達(dá)模式。免疫印跡分析的結(jié)果顯示，與鄰近組織相比，USP22和E2F6蛋白水平分別在75.0%和60%腫瘤標(biāo)本中上調(diào)。此外，幾乎所有E2F6表達(dá)增加的腫瘤組織都具有高水平的USP22。為了探索USP22-E2F6調(diào)控在HCC中的功能重要性，作者通過RNA-seq研究了有無USP22或E2F6沉默的Huh7細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。然后作者根據(jù)E2F6或USP22缺失引起的轉(zhuǎn)錄改變生成了四個(gè)特征，即E2F6 ACTIVITY UP或USP22 ACTIVITY UP和E2F6 ACTIVITY DOWN或USP22 ACTIVITY DOWN，以分析源自TCGALIHC和ICGC數(shù)據(jù)庫的HCC的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)。USP22和E2F6的活性之間的相關(guān)性分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。樣品的GSEA分析顯示E2F6 ACTIVITY DOWN基因在USP22低表達(dá)的腫瘤中富集表達(dá)， E2F6 ACTIVITY UP基因在USP22高表達(dá)的腫瘤中富集表達(dá)。通過生成的E2F6特征對(duì)有無USP22敲低的Huh7細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜分析表明，一組受E2F6正調(diào)控的基因被USP22沉默轉(zhuǎn)錄抑制，而一些E2F6 ACTIVITY DOWN基因被USP22沉默轉(zhuǎn)錄上調(diào)。這些結(jié)果表明USP22和E2F6之間相互作用在HCC中的功能意義。為了解決USP22和E2F6的臨床結(jié)果，作者使用USP22和E2F6 ACTIVITY分析對(duì)來自TCGA或ICGC數(shù)據(jù)庫的HCC樣本進(jìn)行了分類，結(jié)果表明存活概率與HCC樣本中的USP22活性或E2F6活性呈負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí)作者的結(jié)果，作者將USP22過表達(dá)的Huh7細(xì)胞皮下注射到裸鼠中，發(fā)現(xiàn)USP22過表達(dá)顯著促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，其中在表達(dá)外源性USP22的腫瘤中觀察到E2F6積累增強(qiáng)。

研究結(jié)論：USP22表達(dá)升高與E2F6水平及其在HCC中的活性相關(guān)。

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3.USP22-E2F6軸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)AKT激活

????????接下來，作者研究了E2F6和USP22在HCC中的生物學(xué)功能。作者的結(jié)果表明，敲低E2F6或USP22導(dǎo)致細(xì)胞增殖顯著下降，表明E2F6和USP22對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)都是必不可少的。一致地，E2F6或USP22的過表達(dá)增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的增殖。由于作者的發(fā)現(xiàn)將E2F6定位在USP22的下游，作者設(shè)想U(xiǎn)SP22的促腫瘤發(fā)生活性可歸因于E2F6在HCC細(xì)胞中的功能。事實(shí)上，在肝腫瘤細(xì)胞中沉默E2F6可顯著逆轉(zhuǎn)USP22對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。此外，異位E2F6表達(dá)部分恢復(fù)了HCC細(xì)胞中USP22敲低引起的生長(zhǎng)抑制。另一方面，即使在USP22過表達(dá)的情況下，裸鼠中Huh7細(xì)胞的腫瘤形成能力也被E2F6敲低完全削弱。這些結(jié)果表明USP22介導(dǎo)的E2F6穩(wěn)定是調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。

????????據(jù)報(bào)道，USP22有助于HCC細(xì)胞中AKT信號(hào)的過度激活。一致地，作者發(fā)現(xiàn)USP22有效地促進(jìn)了Huh7和HepG2細(xì)胞中的AKT激活。為了研究E2F6是否參與USP22促進(jìn)的AKT激活，作者檢查了有無E2F6的細(xì)胞中的p-AKT水平。發(fā)現(xiàn)沉默E2F6顯著削弱了穩(wěn)態(tài)下的AKT磷酸化并有效抵消了USP22介導(dǎo)的AKT激活，表明E2F6穩(wěn)定性決定了USP22誘導(dǎo)的HCCAKT的過度激活。

研究結(jié)論：USP22-E2F6軸促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)AKT激活。

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4.E2F6對(duì)DUSP1的抑制導(dǎo)致HCC細(xì)胞中的AKT激活

????????為了調(diào)節(jié)AKT激活，作者分析了從有無USP22或E2F6沉默的細(xì)胞中獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，在敲除USP22或E2F6的細(xì)胞中顯示差異表達(dá)的磷酸酶中，DUSP1同時(shí)上調(diào)。一致地，通過測(cè)量USP22敲低后細(xì)胞中六種磷酸酶的蛋白質(zhì)水平，作者發(fā)現(xiàn)只有DUSP1蛋白質(zhì)豐度顯著增加。類似地，在E2F6敲低細(xì)胞中觀察到DUSP1蛋白水平增加。為了證實(shí)這些結(jié)果，作者隨后分析了TCGALIHC腫瘤標(biāo)本中磷酸酶的轉(zhuǎn)錄譜。與USP22高表達(dá)的樣本相比，發(fā)現(xiàn)DUSP1表達(dá)僅在USP22水平低的樣本中增加。為了確定E2F6參與USP22介導(dǎo)的DUSP1抑制，作者敲低了過表達(dá)USP22的腫瘤細(xì)胞中的E2F6。結(jié)果表明，沉默E2F6有效地逆轉(zhuǎn)了USP22介導(dǎo)的DUSP1抑制。接下來，作者使用ChIP-PCR確定了E2F6在DUSP1上的結(jié)合位置。正如預(yù)期的那樣，E2F6能夠結(jié)合到DUSP1啟動(dòng)子區(qū)域，并且這種結(jié)合受到USP22沉默的負(fù)調(diào)節(jié)。因此，作者的數(shù)據(jù)表明DUSP1轉(zhuǎn)錄的抑制可能是USP22-E2F6在HCC中的功能的基礎(chǔ)。接下來，作者研究了DUSP1抑制是否參與USP22介導(dǎo)的AKT激活。觀察到異位DUSP1表達(dá)顯著抑制AKT磷酸化，而敲除DUSP1增加磷酸化AKT表達(dá)。

研究結(jié)論：USP22通過E2F6介導(dǎo)的DUSP1抑制激活A(yù)KT信號(hào)傳導(dǎo)。

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5.DUSP1消除USP22-E2F6介導(dǎo)的HCC腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

????????DUSP1已被確定為負(fù)調(diào)節(jié)HCC中腫瘤增殖的腫瘤抑制因子。因此，作者探討了DUSP1對(duì)USP22在肝腫瘤細(xì)胞中促腫瘤發(fā)生活性的影響。作者觀察到DUSP1敲低顯著改善了細(xì)胞增殖，而異位DUSP1表達(dá)產(chǎn)生了相反的效果。值得注意的是，DUSP1表達(dá)足以消除由USP22過表達(dá)引起的細(xì)胞增殖增強(qiáng)。相反，由E2F6抑制引起的腫瘤細(xì)胞增殖受損可以通過DUSP1抑制顯著抵消。

研究結(jié)論：E2F6對(duì)DUSP1的下調(diào)是導(dǎo)致USP22在HCC中促腫瘤發(fā)生功能的關(guān)鍵事件。

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結(jié)論與討論

????????在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)敲除DUSP1增強(qiáng)了AKT信號(hào)通路,而USP22介導(dǎo)的致癌作用需要E2F6抑制DUSP1。因此，在此作者提供證據(jù)表明USP22-E2F6軸對(duì)DUSP1的抑制是激活A(yù)KT信號(hào)傳導(dǎo)并驅(qū)動(dòng)HCC生長(zhǎng)的上游事件對(duì)由USP22、E2F6和DUSP1組成的分子機(jī)制在HCC中的功能的認(rèn)識(shí)可能有助于設(shè)計(jì)治療HCC的新策略。

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Thank you!

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原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.canlet.2021.07.044