進(jìn)展性多發(fā)性硬化癥（MS）的特征是持續(xù)性神經(jīng)退行性變，會(huì)導(dǎo)致累積性殘疾且目前治療無(wú)響應(yīng)。不完全了解其復(fù)雜發(fā)病機(jī)制限制了預(yù)防MS藥物開發(fā)。本研究對(duì)新鮮冷凍人MS腦組織進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組和空間蛋白質(zhì)組研究，確定導(dǎo)致進(jìn)展性MS發(fā)病的多細(xì)胞機(jī)制，追蹤其與神經(jīng)退行性變空間分布相關(guān)的起源。通過(guò)解析局部微環(huán)境中的配體-受體相互作用，研究發(fā)現(xiàn)早期神經(jīng)元衰退區(qū)域內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和抗炎細(xì)胞間通訊丟失，MS樣本神經(jīng)元損傷相關(guān)蛋白質(zhì)與已發(fā)表的體內(nèi)敲低和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病模型表型一致，表明其具有作為進(jìn)展性MS治療靶點(diǎn)的潛力?；趯?duì)人類患病組織中促進(jìn)這種衰弱性疾病復(fù)雜細(xì)胞和信號(hào)動(dòng)力學(xué)的理解，該研究結(jié)果為藥物研發(fā)提供了一個(gè)嶄新思路。

?研究材料

14個(gè)進(jìn)展性MS病人和7個(gè)對(duì)照組新鮮冷凍的大腦皮層組織

?技術(shù)路線

步驟1：通過(guò)空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)MS與對(duì)照組的神經(jīng)元完整性的特征差異；

步驟2：結(jié)合空間蛋白組進(jìn)一步證明空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)果；

步驟3：結(jié)合單細(xì)胞數(shù)據(jù)挖掘多發(fā)性硬化神經(jīng)退行性疾病的早期細(xì)胞間通訊通路；

步驟4：動(dòng)物模型驗(yàn)證了靶基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用；

步驟5：發(fā)現(xiàn)MS治療潛在靶點(diǎn)。

?研究結(jié)果

1. 空間轉(zhuǎn)錄組追蹤神經(jīng)退行性變

為了系統(tǒng)地描繪神經(jīng)退行性變通路，從完整的神經(jīng)元皮層灰質(zhì)區(qū)域到以神經(jīng)元衰退為特征的區(qū)域，對(duì)13名進(jìn)展性多發(fā)性硬化癥患者和5名對(duì)照組的新鮮冷凍皮質(zhì)腦組織進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究(1a)。據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)，本研究患者群體在很大程度上屬于MS的一個(gè)階段，且持續(xù)神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展占主導(dǎo)位置。共分析37張組織切片(32張MS切片和5張對(duì)照切片)，除對(duì)照只包括白質(zhì)切片外，其余均包括皮質(zhì)灰質(zhì)組織。為了跟蹤灰質(zhì)中的神經(jīng)衰退，首先將完整神經(jīng)元特征映射到空間轉(zhuǎn)錄組，與對(duì)照病例相比，MS患者完整神經(jīng)元特征顯著減少，即MS相關(guān)神經(jīng)衰退狀態(tài) (1b)。通過(guò)識(shí)別MS患者大腦中的灰質(zhì)(GM)區(qū)域，在與對(duì)照樣本相同的范圍內(nèi)，顯示出完整神經(jīng)元特征的富集，分類為“MS GM完整”；與對(duì)照組織相比，完整神經(jīng)元特征減少的區(qū)域，分類為“MS GM衰退”(1b)。

2. MS神經(jīng)退行性變通路可跨細(xì)胞類型發(fā)揮作用

突觸組裝，突觸通訊和可塑性，神經(jīng)元突起調(diào)節(jié)，髓鞘形成，免疫細(xì)胞活化和組織重塑生物過(guò)程代表神經(jīng)元衰退不同階段的基因組模塊(2a,b)，細(xì)胞間通訊介導(dǎo)的致病過(guò)程具有很強(qiáng)的共依賴性(2b,c)，篩選與神經(jīng)退行性變疾病進(jìn)展相關(guān)最強(qiáng)模塊，并確定其調(diào)控的方向性，將每個(gè)模塊(特征基因)總表達(dá)與相同灰質(zhì)位置完整神經(jīng)元特征的減少相關(guān)聯(lián)(2d-g)。隨著神經(jīng)退行性變加重，與突觸通訊、突觸可塑性和神經(jīng)元投射維持相關(guān)的模塊表達(dá)逐漸減少(2d)。相反，與先天免疫細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的炎癥和組織重塑過(guò)程上調(diào)(2f)。少突膠質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的髓鞘形成也隨著完整神經(jīng)元特征的減少而上調(diào)，表明盡管髓鞘形成通路活躍，但進(jìn)展性MS仍發(fā)生神經(jīng)退行性變(2f)。在正常表達(dá)完整神經(jīng)元特征區(qū)域，炎癥通路的表達(dá)最少(2f)。在完整的MS灰質(zhì)中已經(jīng)觀察到突觸和軸突相關(guān)通路的下調(diào)，這意味著這些變化在神經(jīng)退行性變的早期被觸發(fā)，不單純是炎癥影響。

為了在蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證本研究結(jié)果，在14例進(jìn)展性MS患者(56個(gè)樣本)和7例對(duì)照組(9個(gè)樣本)的65份灰質(zhì)樣本相鄰組織區(qū)域切片(＜0.06 mm3)使用高靈敏質(zhì)譜法，共鑒定出4541種特異蛋白。以先前定義完整神經(jīng)元的特征富集，再一次觀察到類似的擬時(shí)間連續(xù)體減少完整的神經(jīng)元特征，如轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所示(3c)，測(cè)試共表達(dá)模塊和神經(jīng)退行性變之間關(guān)系的多模態(tài)一致性，用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)評(píng)估了4093個(gè)基因，除了模塊4(“神經(jīng)元投射”)和模塊8(“軸向樹突狀蛋白運(yùn)輸”)在蛋白質(zhì)水平上與神經(jīng)退行性變不相關(guān)外，所有模塊的RNA和蛋白質(zhì)水平都與神經(jīng)退行性變相關(guān) (3d)。

3. 多發(fā)性硬化神經(jīng)退行性疾病的早期細(xì)胞間通訊

結(jié)合多模態(tài)驗(yàn)證的疾病通路與細(xì)胞間通訊，嘗試識(shí)別隨著神經(jīng)退行性變進(jìn)展而改變的配體-受體相互作用。評(píng)估83,256個(gè)灰質(zhì)龕中1,396對(duì)組合配體-受體的表達(dá)值(4a)。該方法共獲得61對(duì)配體受體:其中15對(duì)在完整MS灰質(zhì)中減少，在退化MS灰質(zhì)中進(jìn)一步減少，46對(duì)在完整MS灰質(zhì)中增加，其中16對(duì)在退化MS灰質(zhì)中也增加，30對(duì)等小于等于對(duì)照水平(4d)。RNA水平和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)到的配體和受體表達(dá)揭示MS神經(jīng)退行性疾病早期細(xì)胞間通訊的機(jī)制模式，抗炎相互作用(25%，定義為免疫抑制)，促炎相互作用(25%，定義為促進(jìn)免疫反應(yīng))和營(yíng)養(yǎng)相互作用(31%，定義為促進(jìn)發(fā)育、增殖或細(xì)胞存活的生長(zhǎng)因子)(4d)。

在完整的MS灰質(zhì)中存在相互競(jìng)爭(zhēng)的促炎和抗炎通訊，似乎都有多層冗余(4h)。在完整MS灰質(zhì)中出現(xiàn)的促炎相互作用，在退化的皮質(zhì)灰質(zhì)區(qū)域中大部分仍然存在或進(jìn)一步增加(4d-h)。在完整MS灰質(zhì)中，促炎刺激和抗炎刺激的平衡與在神經(jīng)退行性變?cè)缙谟^察到的炎癥相關(guān)基因模塊的整體低表達(dá)一致(2f)，說(shuō)明可通過(guò)靶向治療保持或誘導(dǎo)這種狀態(tài)的受體。與對(duì)照組相比，支持細(xì)胞活力和生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)相互作用在完整MS灰質(zhì)中減少，并且在退化區(qū)域進(jìn)一步減少。代償性營(yíng)養(yǎng)相互作用在完整MS灰質(zhì)中上調(diào)，但在退化區(qū)域減少（4d)。表明進(jìn)展性MS患者灰質(zhì)中的生長(zhǎng)因子環(huán)境發(fā)生了改變。

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)與皮質(zhì)灰質(zhì)的snRNA-seq數(shù)據(jù)和血液免疫細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)合驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間完整的MS灰質(zhì)中相互作用減少(5d,g)。神經(jīng)元在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為生存信號(hào)的重要來(lái)源，說(shuō)明神經(jīng)變性可能導(dǎo)致其他細(xì)胞類型的變性。

在完整MS灰質(zhì)中最豐富的相互作用(“完整MS GM”)的特征是細(xì)胞類型多樣性顯著增加，涉及神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(OPC)、內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞(5e,h)。在退化的MS灰質(zhì)中，相互作用進(jìn)一步上調(diào)(“MS GM”)，主要是小膠質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和入侵單核細(xì)胞。在進(jìn)展性MS患者中，看似完整的灰質(zhì)區(qū)域似乎表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性的保護(hù)性和致病性特征，細(xì)胞存活除了炎癥本身還可能特定的抗炎和營(yíng)養(yǎng)影響。

4. 動(dòng)物模型驗(yàn)證了靶基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用

為了測(cè)試對(duì)進(jìn)展性MS早期神經(jīng)退行性變相關(guān)的配體-受體相互作用的優(yōu)先排序是否成功地確定了適合治療靶向的致病基因。首先，使用已發(fā)表的全基因組體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)必需基因敲除篩選數(shù)據(jù)測(cè)試了所有候選配體受體基因(促炎候選基因、抗炎候選基因和營(yíng)養(yǎng)候選基因)的表型效應(yīng)(6a)。其次，使用多個(gè)已發(fā)表的體內(nèi)CNS疾病模型（具有廣泛的CNS損傷途徑）系統(tǒng)地評(píng)估了候選基因擾動(dòng)的影響，已發(fā)表的候選配體受體基因組的體內(nèi)敲除數(shù)據(jù)顯示，CNS細(xì)胞(表型強(qiáng)度)顯著減少(6a,c)，即不適合進(jìn)展性MS的治療抑制靶點(diǎn)。

調(diào)研2,945項(xiàng)研究中候選基因之一在體內(nèi)被特異性干擾實(shí)驗(yàn)(敲除，過(guò)表達(dá)，激活治療，抑制治療)和臨床相關(guān)報(bào)告讀數(shù)(改善、惡化或?qū)δＰ蜔o(wú)影響)(6b、d)，篩選106個(gè)候選配體受體基因中的58個(gè)(55%)相匹配。61對(duì)(75%)配體-受體對(duì)中有46對(duì)在完整MS灰質(zhì)和對(duì)照樣本之間差異共表達(dá)至少一個(gè)相互作用的數(shù)據(jù)。促炎候選物大多對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型有害，而抗炎和營(yíng)養(yǎng)候選物主要發(fā)揮保護(hù)作用(6d)。當(dāng)有證據(jù)表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)，SIRPA - CD47相互作用提供了保護(hù)作用這與其他證據(jù)表明具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用的證據(jù)相一致。

5. MS神經(jīng)變性的新治療靶點(diǎn)

為了研究配體-受體相互作用與神經(jīng)變性潛在過(guò)程之間的關(guān)系，將每種配體-受體相互作用的發(fā)生與相同灰質(zhì)位置基因共表達(dá)模塊的調(diào)節(jié)聯(lián)系起來(lái)(7a)。推導(dǎo)每個(gè)候選配體-受體相互作用與所有模塊的平均絕對(duì)相關(guān)性(7a,b)，營(yíng)養(yǎng)和抗炎細(xì)胞間通訊的局部失敗會(huì)導(dǎo)致MS患者大腦皮質(zhì)組織的多組分神經(jīng)退行性變，為了解決廣泛靶點(diǎn)產(chǎn)生的副作用問題，作者分析了來(lái)自 GTEx項(xiàng)目包括948個(gè)供體52個(gè)組織的16,704個(gè)RNA測(cè)序樣本受體表達(dá)，對(duì)于每個(gè)受體，明確了目標(biāo)受體在多組分神經(jīng)變性(平均絕對(duì)模塊相關(guān)性)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)富集(CNS特異性評(píng)分)之間定義的坐標(biāo)系中的位置(7d)，理想的治療目標(biāo)即是將這兩種特性最大化。人蛋白圖譜的免疫組化數(shù)據(jù)驗(yàn)證了這幾個(gè)靶點(diǎn)在蛋白水平上的CNS富集表達(dá)(7i - l)。除了量化中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性外，還可觀察到的中樞神經(jīng)系統(tǒng)外的表達(dá)模式。在多發(fā)性硬化癥中，SIRPA的激動(dòng)性靶向有望對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周免疫系統(tǒng)產(chǎn)生理想的影響。

?小編小結(jié)

為了確定MS神經(jīng)退行性變?cè)缙诩?xì)胞間通訊的機(jī)制，使用先前發(fā)表的生物學(xué)功能注釋了每個(gè)配體-受體對(duì)的相互作用，最主要的是抗炎相互作用(所有候選相互作用的25%，定義為免疫抑制)、促炎相互作用(25%，定義為促進(jìn)免疫反應(yīng))和營(yíng)養(yǎng)相互作用(31%，定義為促進(jìn)發(fā)育、增殖或細(xì)胞存活的生長(zhǎng)因子)。通過(guò)比較MS患者和對(duì)照組的配體-受體的相互作用情況，發(fā)現(xiàn)患者早期神經(jīng)元衰退區(qū)域內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)和抗炎細(xì)胞間通訊丟失。進(jìn)一步地，研究人員在動(dòng)物模型中驗(yàn)證相關(guān)靶基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用，研究證實(shí)了患者樣本中與神經(jīng)元損傷相關(guān)蛋白質(zhì)具有與已發(fā)表的體內(nèi)敲低和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病模型一致的表型。

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